建立稳定过表达目的基因的细胞系以研究基因功能，可通过稳定转染法实现，即在转染后筛选单克隆细胞。 通过 逆转录病毒感染。在此，我们展示了通过该方法生成的HT29-DR3细胞系揭示了死亡受体3（DR3）在有丝分裂抑制剂诱导的细胞凋亡中的作用机制。
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方法文章
建立过表达DR3的细胞系以评估对有丝分裂抑制治疗的凋亡反应
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
通过调控目的基因的表达水平，可以研究其功能，例如利用基因敲低细胞系降低其表达，或利用过表达细胞系提高其表达。瞬时转染和稳定转染是外源基因表达常用的两种方法。瞬时转染仅适用于短期表达，而稳定转染可使外源基因整合到宿主细胞基因组中，实现持续表达。因此，稳定转染通常用于长期遗传调控的研究。本文介绍一种简单的实验方案，用于构建稳定过表达带标签的死亡受体3（DR3）的细胞系，以探究DR3的功能。我们在逆转录病毒感染后挑选单克隆，以确保稳定细胞系的均一性和纯度。利用该方案构建的稳定细胞系可使DR3缺陷的HT29细胞对抗有丝分裂药物产生敏感性，从而在HT29细胞中重建凋亡反应。此外，DR3上的FLAG标签弥补了优质DR3抗体难以获得的不足，并有助于通过生物化学方法研究抗有丝分裂药物诱导凋亡的分子机制。
引言
异源基因表达常用于研究目的基因的功能。在细胞与分子生物学中，瞬时转染和稳定转染是两种常用方法，用于将一段DNA或RNA导入宿主细胞。1,2瞬时转染的DNA或RNA无法传递给子代细胞，因此遗传改变只能维持较短时间。相比之下，在稳定转染的细胞中，外源基因被整合到宿主细胞基因组中，从而在细胞系中持续表达。因此，稳定转染通常用于长期基因调控的研究。稳定细胞系还可作为异种移植移植物植入小鼠模型中 体内 研究3稳定转染可分为病毒性和非病毒性两类。与非病毒性转染相比，病毒感染能以更高的效率将基因导入更多种类的人类细胞中。4,5,6,7此外，来自单克隆的稳定细胞系具有均一性和克隆纯度的优势。
不受控制的细胞生长和分裂是癌症最显著的特征。在临床治疗中，抗有丝分裂药物是多种肿瘤的主要治疗手段8。然而，抗有丝分裂药物的一些重要局限性不容忽视。首先，这类化疗药物在杀伤异常癌细胞的同时也可能杀死正常细胞，从而导致严重的副....
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方案
请注意，本文所述所有小鼠实验均经清华大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并遵循其规定进行。
1. DR3 过表达细胞系的构建
- 通过将带有C端3x FLAG标签的全长DR3 cDNA插入到逆转录病毒载体pMXs-IRES-Blasticidin的BamHI/XhoI限制性酶切位点，构建用于DR3表达的质粒（pMXs-IRES-DR3-FLAG）。
- 在60 mm培养皿中用4 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养Plat-A细胞。次日，当细胞融合度达到80% - 90%时，按照制造商说明书使用转染试剂（见材料表）将2 μg质粒pMXs-IRES-DR3-FLAG转染入细胞20。
- 72小时后，收集上清液，用0.45 μm无菌滤器过滤培养基，并将病毒悬液避光保存于4 °C。
- 在60 mm培养皿中用DMEM培养HT29细胞，并在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞。
- 次日，当细胞融合度达到30% - 50%时，在每毫升病毒悬液中加入8 μg的1,5-二甲基-1,5-二氮杂十一烷聚合溴化物，用2 mL病毒悬液感染细胞。在37 °C孵育4 - 6小时后，吸除病毒悬液，加入4 mL新鲜DMEM，并将培养皿放回培养箱。
- 感染后24小时，弃去培养皿中的培养....
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结果
稳定表达DR3的HT29细胞的表征如图1所示。这些克隆表达不同水平的DR3，而作为阴性对照的野生型细胞则不显示外源基因的表达。此处仅展示五个克隆，其中克隆1和克隆5表达DR3的水平最高。我们选择克隆1和克隆5用于后续实验。
通过倒置显微镜在10倍放大倍数下观察了给予重氮酰胺后HT29和HT29-DR3细胞的形态，结果如图2所示。经10 nM重氮酰胺处理48小时后，HT29-DR3细胞表现出明显的凋亡特征，包括细胞膜破裂和细胞碎片（下图）；而HT29细胞仅表现出有丝分裂阻滞，细胞完整，呈圆形（上图）。
HT29 和 HT29-DR3 细胞经重氮酰胺处理后的细胞活力如图3
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讨论
在本文中，我们描述了一种生成 HT29-DR3 稳定细胞系的方法。HT29-DR3 细胞为研究 DR3 在抗有丝分裂药物诱导凋亡过程中所参与的分子机制提供了一个模型。该方法具有良好的通用性和可重复性。为确保实验成功，需重点关注方案中的四个关键步骤：首先，为获得足够高的病毒滴度，建议在 Plat-A 细胞融合度达到 80%–90% 时进行 DNA 转染。其次，病毒悬液应避光保存于 4 °C，且保存时间不应超过 2 周。第三，在将感染后的细胞分种至 150 mm 培养皿时，建议进行梯度稀释，以获得分离良好的单克隆集落，因为不同细胞的感染效率存在差异。最后，在挑取单个克隆时，应避免周围其他克隆的污染。
该方案适用于大多数细胞系，但对于不易形成单细胞克隆的细胞可能效果较差。在此类情况下，需要采用其他细胞分选技术，例如联合使用抗生素与荧光激活细胞分选（FACS）。
稳定转染包括病毒和非病毒方法。在本方案中，我们采用逆转录病毒感染的方法来获得过表达DR3的细胞，理由是物理方法（如电穿孔）对细胞的毒性较大.......
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致谢
本工作获得了清华大学资助项目 53110000117（资助 G.W.）和 043222019（资助 X.W.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | 添加10% FBS和1%青霉素/链霉素 |
| 发光法细胞活力检测 | Promega | G7571 | |
| 紫杉醇 | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-二甲基-1,5-二氮杂十一烷多甲基溴化物 | Santa Cruz | sc-134220 | |
| 转染试剂 | Promega | E2311 | |
| 抗小鼠二抗 | Jackson ImmumoResearch | 115-035-166 | |
| 抗Flag抗体 | Sigma | F-3165 | |
| HT29细胞系 | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A细胞系 | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| 克隆环 | Sigma | C1059 | |
| 细胞成像多功能读板仪 | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53倒置显微镜 | Olympus | CKX53 | |
| 12孔细胞培养板 | Nest | 712001 | |
| 60 mm细胞培养皿 | Nest | 705001 | |
| 15 mL离心管 | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm无菌滤膜 | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96孔白色聚苯乙烯微孔板 | Corning | 3903 | |
| Western ECL底物 | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| 脱色摇床 | HINOTECH | TS-2000A | |
| 杀稻瘟菌素 | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| 自动细胞计数仪 | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I减血清培养基 | Thermo Fisher | 31985070 |
参考文献
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strat....
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重印与许可
