此处介绍一种利用表达增强型绿色荧光蛋白的实验方案，用于评估小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用 大肠杆菌.
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
使用表达增强型绿色荧光蛋白的Escherichia Coli评估小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
本文描述了一种简单且可重复的吞噬作用检测方法。该方法的第一部分包括构建pET-SUMO-EGFP载体（SUMO = 小泛素样修饰蛋白）并在其中表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP） 大肠杆菌 (BL21DE)。表达EGFP的 E. coli 在37 °C下与巨噬细胞共孵育1小时；阴性对照组在冰上孵育相同时间。随后，巨噬细胞即可用于检测。该技术的优点在于步骤简单直接，且可通过流式细胞仪和荧光显微镜两种方法检测吞噬作用。表达EGFP的 E. coli 即使在用多聚甲醛固定巨噬细胞后，仍能保持稳定并显示出强烈的荧光信号。该方法不仅适用于体外培养的巨噬细胞系或原代巨噬细胞的评估，也适用于外周血单个核细胞中粒细胞和单核细胞吞噬功能的评价。结果显示，来自年轻（8周龄）小鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬能力高于来自老龄（16月龄）小鼠的巨噬细胞。综上所述，该方法可用于检测巨噬细胞的吞噬功能，适用于先天免疫系统功能的研究。
引言
巨噬细胞吞噬实验常用于研究先天免疫功能。先天免疫反应可能提示机体对感染的易感性。巨噬细胞系在免疫学研究中被广泛使用。然而，长期传代可能导致这些细胞系发生基因丢失及免疫功能受损。因此，原代腹腔巨噬细胞是研究巨噬细胞功能的理想对象1。
尽管人们认为衰老机体的先天免疫反应仍然完整，但其吞噬能力可能较年轻机体有所下降2,3。本文将介绍一种利用表达EGFP的大肠杆菌（E. coli）评估年轻（8周龄）和老龄（16月龄）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的方法，该方法简便、快速且经济可行。
使用表达EGFP的大肠杆菌（E. coli）菌株是本实验的一个优势，因为这些细菌具有良好的稳定性，即使在巨噬细胞经4%（w/v）多聚甲醛固定后仍能保持强烈的荧光信号。此外，使用表达EGFP的大肠杆菌（E. coli）可避免吞噬作用发生后额外的染色步骤，从而节省时间。更重要的是，巨噬细胞对大肠杆菌（E. coli）表面抗原具有免疫应答性，因此与使用表达EGFP的真菌或荧光素标记的微球相比，大肠杆菌（E. coli）更适用于吞噬作用实验。
使用表达EGF....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有操作均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行，并经大连医科大学实验动物福利与使用委员会批准。实验所用16月龄（体重30–35 g）和8周龄（体重20–25 g）SPF级（无特定病原体）雄性C57BL/6小鼠均购自大连医科大学SPF级动物中心。所有小鼠均饲养于动物房中，自由摄食饮水 随意摄取温度保持在20-24 °C，湿度为40%-70%，光照条件为12小时光照/12小时黑暗。动物在实验前至少适应环境7天。
1. pET-SUMO-EGFP 质粒的构建及 EGFP 表达的诱导
- 合成EGFP基因片段（由定制基因合成服务合成的717 bp序列，序列信息见材料表和补充文件1），使用上游引物（5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3'）和下游引物（5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'），以高保真Taq DNA聚合酶扩增该片段。
- 为确保聚合酶链式反应（PCR）产物在下一阶段TA克隆中具有单个3'端腺苷突出端，在最后一个循环后于72 °C延伸30分钟（PCR反应条件见补充文件1）。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
- 采用TA克隆法5将PCR产物克隆至pET-SUMO载体（见材料表<....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
pET-SUMO 载体利用一种小泛素样修饰蛋白，以实现目标蛋白在 E. coli 中的天然表达。SUMO 融合可显著提高 EGFP 的溶解度，使其更易于被检测。若乳糖成功诱导 EGFP 表达，则可在暗处观察到绿色菌落（图 1A）。在荧光显微镜下使用 40 倍物镜，可观察到代表表达 EGFP 的 E. coli 的绿色荧光点（图 1B）。
显微镜分析显示了来自年轻组和老龄组小鼠的腹腔巨噬细胞的荧光图像（图1C）。图1C展示了F-actin的红色荧光、表达EGFP的大肠杆菌（E. coli）的绿色荧光、DAPI细胞核染色的蓝色荧光，以及三个荧光通道的合并图像。16月龄.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案中的步骤非常简单直接。其中一个关键步骤是在E. coli中诱导EGFP表达。通常情况下，当计划在原核生物（如E. coli）中表达真核生物来源的基因（如EGFP）时，存在蛋白质形成无活性聚集体（包涵体）的风险，这会改变蛋白质的天然结构和活性。通过使用pET-SUMO载体并构建pET-SUMO-EGFP质粒，成功表达了EGFP-SUMO融合蛋白，其荧光信号足够强，可通过荧光显微镜和流式细胞仪检测到。
另一个关键步骤是淬灭未被巨噬细胞内化的细菌的荧光。尽管台盼蓝已被证明可淬灭异硫氰酸荧光素（FITC）标记的热灭活细菌的荧光，但其对活的 E. coli 无效。使用0.8%的结晶紫水溶液可淬灭大部分结合在细胞表面的 E. coli 的荧光。一些文献建议用抗生素洗涤代替台盼蓝洗涤可能有助于淬灭荧光，但在本实验中该方法并不有效10。
细胞密度可能限制该技术的应用。由于细胞由淋巴细胞和巨噬细胞的混合物组成，在从小鼠腹.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究受到中国国家自然科学基金（编号：31800046）和辽宁省自然科学基金（编号：20170540262）的资助。本研究在大连医科大学附属第二医院科研中心实验室完成。作者感谢桑晓林在流式细胞术方面的协助，感谢曲波和杨东川在视频制作过程中的帮助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BD FACSCanto II 流式细胞仪 | BD Biosciences | - | |
| 生物素标记抗小鼠 CD16/32 抗体 | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO 蛋白表达系统 | Invitrogen | K300-01 | |
| 定制基因合成服务 | Takara Biotech. | - | |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐） | ThermoFisher | D1306 | |
| 用于流式细胞术的 F4/80-PE 抗小鼠抗体 | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B 倒置显微镜 | Leica Microsystems | - | |
| PE 标记大鼠 IgG2a，κ 同型对照抗体 | Biolegend | Cat400507 | |
| 鬼笔环肽 633 荧光染料偶联工作液 | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| 巯基乙酸盐培养基 | Sigma-Aldrich | T9032 |
参考文献
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749(2015).
- Iskander, K. N., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
