本研究描述了一种高通量、 基于成像的微中和试验以测定针对呼吸道合胞病毒（RSV）的中和抗体滴度。该检测方法已在不同类型的样本中进行过验证。
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摘要
摘要
呼吸道合胞病毒特异性中和抗体（RSV NAbs）是抵抗呼吸道合胞病毒感染的重要保护性标志。目前全球使用多种不同的检测方法，因此亟需一种准确且高通量的RSV NAbs检测方法。本文介绍一种基于成像的微中和检测法，该方法已用于呼吸道合胞病毒A亚群的检测，并可进一步适用于B亚群及不同类型的样本。该方法具有高度可重复性，参考抗血清的批间变异小于10%。我们认为，该检测方法可在全球众多实验室以相对较低的成本快速建立。开发一种改进的高通量RSV NAbs检测方法，对于推动该检测技术的国际标准化，以及未来新型呼吸道合胞病毒疫苗候选物的评估具有重要意义。
引言
呼吸道合胞病毒（RSV）是全球儿童群体中下呼吸道感染的首要病因1。尽管其疾病负担严重，目前仍无可用的疫苗或治疗方法。自2013年起，世界卫生组织（WHO）已将RSV疫苗的研发列为重大研究优先事项，并每年召开WHO咨询会议2,3。WHO已达成共识，采用RSV中和抗体（NAb）检测来监测疫苗的免疫原性，因为该指标被公认为是保护作用的主要血清学标志4。多项研究及针对抗RSV单克隆抗体帕利珠单抗的临床试验已证实，中和抗体可在一定程度上预防严重的RSV感染，而帕利珠单抗目前是唯一可用的预防策略4。
全球各地的实验室采用多种中和抗体（NAb）检测方法，包括基于细胞的检测和基于分子的检测，这使得标准化工作面临挑战5,6,7,8。然而，传统的斑块减量中和（PRN）试验——通过检测呼吸道合胞病毒（RSV）特异性抗体存在时斑块形成单位（PFU）数量的减少——仍然是金标准
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方案
注意：除非另有说明，所有步骤均须在生物安全二级（BSL2）生物安全柜中进行。在进行PRN实验前，必须预先测定病毒滴度，以确定PRN实验中使用的最佳呼吸道合胞病毒（RSV）浓度。建议将病毒储备液分装为小体积，每次实验仅解冻一次并用于单次中和抗体（NAb）实验。建议同一研究中所有样本的NAb实验均使用同一批病毒储备液。在向细胞培养板中添加前，务必确保培养基和磷酸盐缓冲液（PBS）已预热至37 °C。
1. RSV 病毒滴度测定
注意：根据病毒储备液的数量和重复次数，可按照图1设置检测板。每种病毒储备液应在检测板上进行三份重复梯度稀释，起始浓度最高（即1:10）。通常采用1:10的连续梯度稀释法。A549细胞的培养与维持以及呼吸道合胞病毒（RSV）的培养程序采用标准操作流程，本方案中未予包含。
- 铺板（第1天）
- 将A549细胞重悬于含10%胎牛血清（FCS）和1000 IU青霉素/链霉素（pen/strep）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，浓度为4 × 105/mL。向96孔平底无菌板每孔加入100 μL，每孔含4 × 104个A549细胞。 ....
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结果
在进行PRN实验前，对病毒原液进行从1:10至1:108的系列稀释，以测定其浓度（结果见图5）。根据图5，在1:104和1:105稀释度下可可靠地计数PFU。对同一稀释度下的三个复孔中PFU数量取平均值。由于1:105稀释度下平均斑点数为14，因此该病毒原液的病毒滴度计算如下：
14（斑点平均数）/[10-5（稀释度）× 0.1 mL（接种物体积）] = 1.4 × 107 PFU/mL
采用上述方法，我们已对人源样本中的呼吸道合胞病毒A型（RSV-A）和B型（RSV-B）中和抗体（N.......
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讨论
我们开发并优化了一种简单高效的呼吸道合胞病毒（RSV）微量中和实验方法，该方法可轻松适用于大多数实验室。本实验能够通过计算机图像扫描，在细胞水平上检测病毒感染能力以及中和抗体（NAb）对病毒感染的抑制作用。与传统的噬斑检测方法相比，基于成像的平台结合特异性抗体检测系统显著提高了斑点检测的特异性和灵敏度6,7。该方法可用于对感染性较低的RSV毒株进行表征，并可在进行PRN实验前准确量化RSV的浓度。
建议在每项研究中使用同一批次的病毒原液，以尽量减少不同 RSV 病毒原液批次间的差异。该检测的其他重要方面包括病毒接种浓度的一致性、A549 细胞单层的完整性，以及使用相同的计数设置，以确保检测的一致性和准确性。加入平板的病毒量可通过单独的噬斑病毒滴定实验再次验证。然而，监测 PRN 检测中的阳性对照孔也可反映实际的病毒滴度，且值得在不同检测中持续监控。此外，每块板中均应包含参考血清，这是另一项质量控制措施，以确保检测的可重复性。我们的实验未使用近期经验证的 NIBSC .......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢所有参与人员。我们感谢维多利亚州政府运营基础设施支持计划的支持。PVL 是澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）职业发展研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞系 | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 由昆士兰大学Keith Chappell博士提供 |
| 病毒株 | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | 批号 60430286 |
| 试剂 | |||
| 丙酮 | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor 驴抗山羊IgG（储存于4 °C） | Life Technologies | A11055 | |
| CMC钠盐粉末 | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM（无血清，3.7 g/L NaHC，P/S）（储存于4 °C） | Scientific Services – 组织培养 | MCRI内部供应 | |
| 胎牛血清（以50 mL分装储存于-20 °C） | Interpath | SFBS-F | |
| 山羊抗RSV抗体 | Merck | AB1128 | |
| 人多克隆抗呼吸道合胞病毒（RSV）血清（以45 µL分装储存于-20 °C） | BEI Resources | NR-4022 | 注册后可通过BEI Resources免费订购。该血清属于人抗RSV血清和免疫球蛋白系列（NR-32832） |
| M199粉末 | Life Technologies | 31100035 | |
| 脱脂奶粉封闭液（储存于4 °C） | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| 青霉素/链霉素（以6 mL分装储存于-20 °C） | Life Technologies | 15140122 | |
| 来自Milli-Q分配器的s.d.H2O | Merck | 内部分配 | |
| 用于培养的无菌1×PBS（储存于4 °C） | Scientific Services – 组织培养 | MCRI内部供应 | |
| 吐温20聚山梨酯 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| 通用耗材 | |||
| 锥形Falcon管（50 mL） | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| 滤器单元0.22 μm（500 mL） | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| 无菌Eppendorf管（1.5 mL） | Australia PL | AM12400 | |
| 无菌平底板（96孔带盖） | Interpath | 655180 | |
| 无菌U型底板（96孔带盖） | Interpath | 650180 | |
| 5 mL移液管 | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL移液管 | Interpath | 607180 | |
| 25 mL移液管 | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| 移液枪头 1-200 µL 透明最大回收率架装预灭菌 10架×96个/包（共960个） | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| 移液枪头 5-20 µL 透明最大回收率架装预灭菌 10架×96个/包（共960个） | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| 移液枪头 100-1,000 µL 透明最大回收率架装预灭菌 10架×100个/包（共1000个） | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| 移液枪头 1-10 µL 透明最大回收率架装预灭菌 10架×100个/包（共1001个） | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| 仪器与软件 | |||
| ELISpot读板系统 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot软件版本5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
参考文献
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al.
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重印与许可
