利用颅骨共培养与组织形态计量学测量骨重塑并重建肿瘤-骨微环境

摘要

颅骨外植体的ex vivo培养可作为研究骨生理学以及评估药物在骨重塑和骨疾病中潜在作用的有力工具。本方案描述了从小鼠新生颅骨中分离颅骨外植体的制备与培养方法，以及其应用。

摘要

骨是一种结缔组织，由成骨细胞、骨细胞、破骨细胞以及矿化的细胞外基质构成，赋予其强度和柔韧性，使其能够实现相应的生理功能。骨持续暴露于多种刺激因素之下，在病理条件下这些刺激可能导致骨重建过程失调。为了研究骨的生物学特性与骨相关疾病，并评估潜在的治疗药物，有必要建立体外（in vitro）和体内（in vivo）模型。

本论文描述了从新生小鼠分离颅骨并进行培养以研究骨形成及骨肿瘤微环境的解剖过程和培养条件。与体外（in vitro）和体内（in vivo）模型相比，这种离体（ex vivo）模型可在定义明确的培养条件下保留组织的三维结构以及骨组织中细胞类型的多样性，从而模拟所需的微环境。因此，该模型可用于研究骨重塑及其机制，以及不同类型细胞之间的相互作用，例如癌细胞与骨组织之间的相互作用。

本实验采用5至7日龄BALB/C小鼠的颅骨进行检测。将获取的半颅骨在胰岛素、乳腺癌细胞（MDA-MB-231）或乳腺癌细胞培养的条件培养基存在下进行培养。经分析发现，胰岛素可诱导新骨形成，而癌细胞及其条件培养基则诱导骨吸收。颅骨模型已成功应用于基础与应用研究，用于研究骨发育及癌症诱导的骨疾病。总体而言，该模型是一种操作简便、信息丰富且成本较低的优良检测方法。

引言

骨是一种动态的结缔组织，具有多种功能，包括支撑肌肉、保护内脏器官和骨髓，以及储存和释放钙离子与生长因子^1,2。为了维持其结构完整性和正常功能，骨组织持续经历着重塑过程。通常而言，骨重塑周期可分为骨吸收和骨形成两个阶段¹。这两个阶段之间的失衡可导致骨病理状态的发生。此外，诸如乳腺癌等疾病也常影响骨的完整性；约70%以上的晚期患者已经或将会发生骨转移。当乳腺癌细胞侵入骨骼后，会干扰骨代谢，导致过度的骨吸收（破骨性病灶）和/或骨形成（成骨性病灶）³。

为了理解骨骼疾病的生物学机制并开发新的治疗方法，有必要深入了解参与骨重塑过程的相关机制。在癌症研究中，探究骨转移过程及其与转移微环境的关系至关重要。1889年，Stephen Paget 提出假说，认为转移的发生是由于肿瘤细胞与靶组织之间存在相容性，并指出转移部位取决于肿瘤对微环境的亲和性⁴。1997年，Mundy 和 Guise 提出了“骨转移恶性循环""的概念，用以解释肿瘤细胞如何改变骨微环境以实现自身的存活与增殖，以及骨微环境如何通过提供钙离子和生长因子来促进肿瘤细胞的生长^5,

方案

本实验所用小鼠均来自BALB/c小鼠品系，雄性和雌性小鼠均随机使用。既往培养实验也曾使用其他品系小鼠，如FVB、Swiss小鼠、CD-1和CsA小鼠^11,12,14。所有小鼠的饲养均遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南附录Q的规定。涉及动物实验的操作均已获得恩塞纳达科学研究与高等教育部中心（CICESE）机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 颅骨剥离

1. 对解剖器械（例如，1 × 2 齿组织镊、直手术剪、解剖剪、细尖镊子、细弯头解剖镊、解剖镊、手术刀）进行灭菌。每次解剖之间可用无菌蒸馏水清洁手术工具，每次清洗半颅骨时可使用无菌 1× PBS。
2. 将无菌解剖器械、水、1× PBS 以及进行操作所需的材料（例如，微量移液器、沉淀玻璃器皿、无菌培养皿）放入超净工作台中。
   注意：整个操作过程需在无菌条件下进行。
3. 向两个 10 cm 的培养皿中各加入 12 mL 无菌 1× PBS。
4. 选取幼鼠并将其放置在超净台附近。
   注意：应从出生后 5–7 天的幼鼠中解剖颅盖骨。
5. 使用解剖镊小心抓取并固定小鼠。
6. 用解剖剪将小鼠断头，并将头部放入含有 PBS....

结果

为了评估颅骨模型中的骨形成情况，我们将半颅骨组织在含有或不含50 µg/mL胰岛素的培养基中进行培养。制备组织切片并进行H&E染色。在这些条件下，组织学结果显示颅骨的结构完整性得以维持，能够清晰识别其不同组成部分（图1）。与对照组相比，经胰岛素处理的颅骨组织中骨组织量有所增加（图2A）。对半颅骨的厚度和骨面积进行定量组织形态学分析，证实与对照组相比，胰岛素处理组的这两个参数均显著增加（图2B）。这些数据表明，该离体（ex vivo）模型方案能够有效重现骨形成条件，具有可行性。

此外，颅骨顶骨 离体 模型可用于模拟癌症及骨微环境条件。本方案用于评估乳腺癌细胞MDA-M.......

讨论

本文描述了一种颅骨ex vivo模型的实验方案，用于评估骨形成或骨吸收，并研究癌细胞与小鼠颅骨之间的相互作用。该技术的关键步骤包括颅骨的解剖、培养、包埋以及组织形态计量学分析。在颅骨解剖过程中，至关重要的是将半颅骨切割成梯形，这将显著有助于后续石蜡包埋时的定位。在研究癌细胞与颅骨相互作用时，应使用未经细胞培养处理的多孔板，以防止癌细胞黏附并生长在塑料表面而非骨组织上。在组织包埋过程中，需仔细调整每块半颅骨的方向，应将其垂直放置，使矢状缘朝向石蜡块的外侧。骨组织的正确定位对于获得一致的组织学切片和可重复的实验结果至关重要。同样，在进行组织形态计量学分析时，为确保一致性，必须在颅骨中明确定义一个特定区域用于测量骨重塑。本文中，我们首先确定冠状缝的位置，然后选定长骨表面作为拍照和测量的区域。

为了实现标准化并建立所述方案，我们对一些既定方法进行了轻微修改。在分离半颅骨时，使用 PBS 冲洗小鼠头部，而非培养基。为了确定对颅骨产生效应所需的细胞数量，将组织与不同数量的乳腺癌细胞共孵育。通常情况下，每 5 × 10⁵ 个癌细胞适用于为期 7 天的实验。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔细胞培养板	Corning	CLS3524
24孔非组织培养板	Falcon	15705-060
2 mL 冻存管	SSI	2341-S0S
抗生素-抗真菌剂	Corning	30-004-CI
牛血清白蛋白（BSA）	Biowest	P6154-100GR
离心机	Eppendorf	22628188	Centrifuge 5810R
盖玻片	Corning	2935-24X50
树脂封片剂（Cytoseal）	Richard Allen	8310-10
二甲基亚砜（DMSO）		D2650-100ML
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），含4.5 g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠	Corning	10-017-CV
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS，10X）	Corning	20-031-CV
包埋盒	Sigma	Z672122-500EA
乙二胺四乙酸（EDTA）	Golden	26400
组织包埋工作站	Thermo Scientific	A81000001
伊红	Golden	60600
无水乙醇	JALMEK	E5325-17P
胎牛血清	Biowest	BIO-S1650-500
滤器	Corning	CLS431229
镊子和剪刀	LANCETA HG	74165
10%缓冲福尔马林	Sigma	HT501320
载玻片（25 × 75 mm）	Premiere	9105
哈里斯苏木精	Jalmek	SH025-13
高轮廓切片刀片	Thermo Scientific	1001259
组织脱水机（Histoquinet）	Thermo Scientific	813150	STP 120
牛胰岛素	Sigma	16634
显微镜	ZEISS	Axio Scope.A1
切片机	Thermo Scientific	905200	MICROM HM 355S
小鼠饲料，18%蛋白，2018S	Harlan	T.2018S.15
血细胞计数板（Neubauer）	VWR	631-0696
橙黄G	Biobasic	OB0674-25G
石蜡	Paraplast	39601006
石蜡切片漂浮浴	Electrothermal	MH8517X1
培养皿	Corning	CLS430167
焰红B	Probiotek	166-02072
台盼蓝	Sigma	T8154
胰蛋白酶-EDTA	Corning	25-051-CI
石蜡分配器	Electrothermal	MH8523BX1
二甲苯	Golden	534056-500ML