Конфокальная томография двуцепочечной РНК и шаблон признание рецепторов в отрицательной смысл РНК вируса
Summary
Двуцепочечной РНК производится во время репликации РНК вируса могут быть признаны рецепторов признание шаблон побудить врожденный иммунный ответ. Для отрицательных смысл РНК-вирусов взаимодействие между низкоуровневых двуцепочечной ДНК и РРСС остается неясным. Мы разработали метод confocal микроскопии для визуализации Аренавирусы двуцепочечной ДНК и ПРР в отдельных клетках.
Abstract
Двуцепочечные РНК (ds) выпускается в виде репликативной промежуточных во время РНК вируса. Признание малым интерферирующим РНК, принимающих шаблон признание рецепторов (ПРРС) как ретиноевой кислоты (RIG-я) как рецепторы (RLRs) рог-I и меланома дифференциация связанные белком 5 (MDA-5) приводит к индукции врожденный иммунный ответ. Формирования и внутриклеточного распределения двуцепочечной ДНК в положительных смысле РНК вируса также характеризуется микроскопии. Многие РНК-вирусов негативные чувства, включая некоторые аренавирусов, триггер врожденный иммунный ответ во время инфекции. Однако отрицательный смысл РНК-вирусов предполагалось производить низкий уровень двуцепочечной ДНК, что препятствует исследования изображений PRR распознавания вирусной РНК. Кроме того инфекции эксперименты с высоко патогенного аренавирусов должны выполняться в высокой сдерживания биобезопасности уровня удобства (BSL-4). Взаимодействие между вирусной РНК и неродным для высоко патогенного вируса РНК практически неизвестны из-за дополнительных технических проблем, которые исследователи должны сталкиваться в зал BSL-4. Недавно была признана моноклональных антител (МАБ) (клон 9D 5), первоначально использовались для обнаружения Пан энтеровирусного специально обнаружить двуцепочечной ДНК с более высокой чувствительности, чем традиционные J2 или K1 антител анти-двуцепочечной ДНК. Здесь, используя 9D 5 антитела, мы описываем confocal микроскопии протокол, который успешно используется для визуализации малым интерферирующим РНК, вирусных белков и PRR одновременно в отдельных клетках, инфицированных Аренавирусы. Протокол также подходит для изображений исследования двуцепочечной ДНК и распределения PRR в патогенные Аренавирусы инфицированных клеток в BSL4 зал.
Introduction
Начальный шаг индукции врожденный иммунный ответ является признание принимающей двуцепочечные РНК (ds), модель распознавания рецепторов (ПРРС) как ретиноевой кислоты (RIG-я) как рецепторы (RLRs) рог-I и меланома дифференциация связанных белка 5 (MDA-5)1. Для положительных смысл РНК-вирусов двуцепочечной ДНК может обычно легко обнаружить с помощью моноклональных антител (МАБ)2анти dsRNA J2 или K1. Взаимодействие между малым интерферирующим РНК и РРСС в положительных нить РНК-вирусов, таких как Пикорнавирусы, характеризуется с помощью конфокальной микроскопии3. Однако для отрицательных смысл РНК вируса, визуализации и характеристика PRR и dsRNA взаимодействия сдерживается отсутствием чувствительных антител к двуцепочечной ДНК. РНК флуоресцентной гибридизации in situ (рыба) был применен к визуализации вирусной РНК и РРСС4. Тем не менее рыба методология требует знания РНК последовательности целевого объекта и не могут быть совместимы с PRR совместно пятнать. Недавно, 9D 5 МАБ, которая первоначально была разработана для диагностики инфекции Пан энтеровирусов, было обнаружено более чувствительны, чем J2 МАБ и может легко обнаружить двуцепочечной ДНК в отрицательной смысле РНК вирус инфекции5,6. Таким образом МАБ 9D 5 — Роман и полезным инструментом для изучения вирусной репликации и взаимодействие между ПРР и вирусной РНК для отрицательных смысл РНК вируса.
Аренавирусов представляют собой семейство одноцепочечной, отрицательные чувство РНК-вирусов, которые включают несколько человеческие патогены, например вирус Ласса (LASV), вирус Хунин (JUNV) и Мачупо вирус (MACV), которые вызывают тяжелые геморрагические лихорадки заболевания людей7. Клинические данные из тяжелых и смертельных случаев Аргентинская геморрагическая лихорадка, вызванных новый мир Аренавирусы JUNV выставку необычно высокий уровень сывороточного ИФН α8,9. Мы показали, что патогенных аренавирусов NW (JUNV и MACV), но не патогенные Аренавирусы старого света, LASV, побудить типа я интерферон (ИФН) ответ в человека моноцитарных дендритных клеток10. Кроме того, RIG-I является одним из датчиков посредничество типа I ИФН ответ в JUNV-инфицированных клеток11. Мы также обнаружили, что белок протеинкиназы R (PKR) рецептор, который традиционно известен для распознавания малым интерферирующим РНК, активируется в болезнетворные СВ Аренавирусы инфекции12. Для более глубокого понимания механизма вирус специфических ИФН ответа во время Аренавирусы инфекции, мы стремились разработать протокол к визуализировать взаимодействие между вирусной РНК и цитоплазматических РРСС.
Инфекция эксперименты с патогенных JUNV, MACV и LASV должны быть выполнены в области биобезопасности уровня 4 (BSL-4) объектов. Таким образом помимо предположительно низкий уровень двуцепочечной ДНК, образованная в Аренавирусы инфекции, выполнения требований по биобезопасности является еще одной проблемой технику при выполнении визуализации исследования для этих высоко патогенные вирусы. Используя 9D 5 антитела и Candid1 # вакцинного штамма JUNV, конфокальная микроскопия-протокол на основе описанных в настоящем докладе, который успешно используется для визуализации малым интерферирующим РНК, вирусных белков и PRR одновременно в клетках, инфицированных Аренавирусы в BSL2 лаборатории. Протокол также подходит для визуализации внутриклеточного распределения двуцепочечной ДНК и PRR во время патогенных Аренавирусы инфекции в BSL4 зал.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для положительных смысл РНК-вирусов и вирусов dsDNA dsRNA легко обнаружены с антитела анти dsRNA J2 широко используется. Однако производить двуцепочечной ДНК на низком уровне или ниже обнаружения с помощью же антитела2считаются отрицательный смысл РНК-вирусов. Таким образом многи…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить UTMB изображений основной зал и Максим Иванников помощи микроскопа.
Эта работа была поддержана Служба общественного здравоохранения грант, RO1AI093445 и RO1AI129198 награждены SP, до UTMB приверженность Фонда P84373 для CH и T32 AI007526 ет.
Materials
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 6 (2006).
- Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses. Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).
- Onomoto, K., et al. Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity. PLoS One. 7, e43031 (2012).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells. Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251 (2018).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. Arenavirdae: The viruses and their replication. Fields Virology. 2, (2006).
- Levis, S. C., et al. Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).
- Levis, S. C., et al. Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever. Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).
- Huang, C., et al. Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells. Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).
- Huang, C., et al. Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659 (2012).
- Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells. Journal of Virology. 91, 20 (2017).
- Emonet, S. F., et al. Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease. Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).
- Child, S. J., et al. Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus. Journal of Virology. 92, 6 (2018).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
