Burada iki örnek işleme teknikleri, buz gibi yüksek basınç birleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut ve mikrodalga destekli örnek işleme, veri odaklı iyon demeti Taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM) ile edinme için gömme en az reçine izledi. Bu bir fare tibial sinir örnek ve Caenorhabditis eleganskullanarak gösterilmiştir.
Açıklanan örnek hazırlama tekniği en iyi kalite bir odaklı iyon demeti Taramalı elektron almak için kullanılan mikroskobu (FIB-SEM), görüntüleme yöntemi için en uygun kontrastlı ultrastructural muhafaza edilmesi birleştirmek için tasarlanmıştır Sıralı görüntüleri 3D imar ve modelleme yığınları. Yüksek basınçlı (HPF) dondurma yakın yerli Yapısal koruma sağlar, ancak sonraki ikame kez dondurma yeterli kontrast için özellikle yüksek kaliteli görüntüleme 3D için gerekli SEM için gerekli olan daha büyük örnek, sağlamaz yeniden yapılanma. Bu nedenle, bu protokol için donma ikame sonra ek zıt adımlar oda sıcaklığında yapılmaktadır. Her ne kadar bu adımlar bir mikrodalga fırında gerçekleştirilir, ayrıca daha uzun kuluçka süreleri gerektirir geleneksel tezgah işleme takip etmek mümkündür. Bırakmak için daha hızlı ve daha hassas hedefleme ve hazırlık FIB-SEM içinde sonraki en az miktarda reçine katıştırma Bu iletişim kuralı tarafından güvenilir bir ultrastructural korunması için yüksek basınçlı donma hazırlık gerektirir, ancak yeterli kontrast sırasında donma ikame FIB-SEM kullanarak birim görüntüleme için kazanmak değil örnekleri için özellikle kullanışlıdır En az reçine gömülmesi ile birlikte, bu iletişim kuralı yüksek kaliteli ses veri toplama için etkin bir iş akışı sağlar.
Yüksek basınç donma kimyasal fiksasyonu1kullanarak geleneksel hazırlama yöntemleri çok daha iyi bir örnek yerel durumunu gösterir yüksek kaliteli ultrastructural koruma elde etmek için örnek hazırlama yönteminin seçimi var. Bu cryo-hazırlama yöntemi myelinated fare doku2 ve model organizma Caenorhabditis elegans3kullanmak için sıkı bir gereği gibi örnekleri için kullanışlıdır. Donma ikame ve reçine gömme sonra bu örnekler genellikle transmisyon elektron mikroskobu (TEM) veya elektron tomografi (ET) tarafından incelenir. Eğer daha büyük birimler için uygun görüntüleme SEM tarafından sık sık kontrast eksikliğinden engel oluyor bizim deneyim yüksek çözünürlüklü büyük ölçekli 3D rekonstrüksiyonlar FIB-SEM veya seri blok-yüz görüntüleme kullanarak yansıma gerekir. YALAN-SEM, görüntü genellikle birincil elektron ışını backscattered elektron tespiti tarafından kaydedilir. Backscattered elektron verim ağır metaller örnek içeriği orantılıdır. Bu nedenle, iletişim kuralları özellikle kontrastı arttırmak için görüntüleme birimi için ek heavy metal emprenye tarafından dizayn edilmiştir. Tür yöntemler kimyasal olarak sabit örneklere dayalı ve Osmiyum tetroxide-thiocarbohydrazide-Osmiyum tetroxide4, bir arada Knott ve ark.5, seri blok-yüz tarafından açıklanan geçerli ve elektron mikroskobu tarama iyon demeti odaklı. Formamide ve pyrogallol6 veya kurşun aspartat7 kullanımı dahil olmak üzere değişiklik için farklı görüntüleme teknikleri başarıyla uygulandı.
Burada sağlanan iletişim kuralı cryo-hazırlık HPF tarafından örneklerin birleştirir ve mikrodalga destekli gelişmiş kontrast için thiocarbohydrazide/Osmiyum tetroxide oda sıcaklığında aseton kullanarak işleme sonraki ile ikame dondurma. Biz yüksek kaliteli ultrastructural korunması için buz gibi yüksek basınç gerektirir örnekleri temsil myelinated nervus tibialis farelerin ve Caenorhabditis elegans, üzerinde göstermek. Buna ek olarak, bu nasıl, dehidratasyon ve infiltrasyon sonra örnekleri ile mümkün olduğunca küçük reçine olarak katıştırılan gösterilir. En az bu reçine8 katıştırma daha hızlı faiz yapısını hedefleme için sağlar ve örnek işleme, kısa sürede ilgi iyon demeti ile bölgenin maruz kalmaları için gerekli dahil olmak üzere üzerinde harcanan zamanı azaltır. Daha fazla örnek hazırlık adımları içinde mikroskop gerçekleştirdikten sonra görüntüleme ve örnek freze sürekli bir yığın görüntüleri elde etmek için yapılır. 3D görselleştirme için görüntü işleme yazılımı (but) veri kümesi bölümlerini yeniden oluşturmak için kullanılır.
Bizim iş akışı nasıl örnekleri birim görüntüleme için en uygun zıt ile en iyi ultrastructural koruma HPF ve donma ikame tarafından birleştirilebilir açıklar. Bu kesinlikle cryo-hazırlık gerektiren örnekleri için yararlıdır. Uygulamaları HPF tarafından hazırlanan küçük örnekleri için sınırlıdır. Farklı doğa, bitki materyali veya mikroorganizmalar, gibi örneklerde bu protokolü adaptasyon gerektirir.
İletişim kuralı en iyi korunması ve FIB-SEM ile seri blok-yüz görüntülemede gerçekleştirmek için karşıtlığı göstermek için geliştirilmiştir Bu nedenle, cryo-immobilizasyon sonrası donma ikame ve mikrodalga destekli işleme kullanarak boyama tarafından takip uygulamak seçti. Bu nedenle, bu iletişim kuralı için yüksek basınçlı donma küçük örnekleri sınırlıdır. 3-6 mm genişliğinde boyutu sınırlamaları ve ~ 200 µm kalınlığında düzgün bu tekniği ile donmuş olabilir örnek boyutunun aynı örnek taşıyıcı boyutunu tarafından oluşturulur. Siyatik sinir çapı uygun donma sağlamak için gerekli 0.2 mm taşıyıcı sığdırmak için çok büyük olduğu için bu fare sinir örnek için söz konusudur. Bu nedenle, tibial sinir veya diğer ince femoral sinir gibi gibi daha küçük bir sinir dikkatli diseksiyon önerilir. Miyelin kılıf germe için hassas olduğundan, büyük taze ve canlı cesaret diseksiyonu sırasında eserler işleme önlemek için özen göstermelidir. Genel olarak, sadece uygun örnekleri elektron mikroskobik çalışmalar için kullanılır.
Mikrodalga destekli işleme ve en az reçine katıştırma hazırlık kadar hız ve işlem hedefleme için tasarlanmıştır. Bir modifiye OTO protokolü4 uygulama mikrodalga destekli işleme oda sıcaklığında kimyasal fiksasyonu için kullanılır. Ev bir mikrodalga yoktur mikrodalgalar yok homojen dağılımı, sıcaklık kontrol edilmez ve uygulanabilir yok vakum olduğunu beri aynı sonuçlar vermez. Küçük bir örnek, kimyasallar daha iyi nüfuz; Bu nedenle, en iyi sonuçları daha küçük örnekleri tarafından sağlanmaktadır. Isıdan zarar örnek görmesini önlemek için sıcaklık kontrolü ve gerekli en az mikrodalga güç uygulanması önemlidir. Uzun işlem süreleri için yol açacak hiçbir mikrodalga kullanılabilir, eğer mikrodalga destekli işleme adımlarını bankta gerçekleştirilebilir. SEM içinde doğrudan hedef yapıları için kadar reçine mümkün olduğunca örnek en baştan çıkarmak çok önemlidir. Bir veri kümesi kaydettikten sonra Post-işleme ham veri dosya boyutunu küçültmek ve sinyal-gürültü oranı artırmak gereklidir. Modern birim görüntüleme teknikleri büyük miktarda veri üretmek. Bu nedenle, hızlı ve yeterli bir şekilde veri işleme gerçekleştirmek için iş istasyonu üzerinde yeterli RAM gereklidir. Hizalama işlemleri için en az iki kat daha fazla RAM veri kümesi boyutu olarak gereklidir.
Bu iletişim kuralı nervus tibialis de C. elegansolduğu gibi fare üzerinde test edilmiştir. Hall ve ark. 12 kullanılan benzer bir geliştirme adım tezgah üzerinde onların dondurma ikame sonra hazırlanması için C. elegans. Herhangi bir diğer model organizma için Zebra balığı gibi büyük olasılıkla gerekli ayarlamaları Protokolü vardır. Kontrast geliştirme18için kullanılan su ilavesi donma ikame kokteyl gibi kompozisyonu değiştirmek için bir olası değişiklik olduğunu. Ayrıca, donma değiştirme süresi için örnek adapte zorunda ve hızlı donma ikame protokolü19göre önemli ölçüde kısaltılabilir. Ajitasyon dondurma yerine koyma işlemi20hızlandırılması için uygulama bir ihtimal. Donma ikame sonra daha fazla değişiklikler, kimyasallar ve Osmiyum tetroxide21tekrarlanan uygulama gibi mümkündür. Mikrodalga işleme sırasında sıcaklık, kuluçka süreleri ve güç ayarlarını sonuçları ilgili örnek için optimize etmek için çeşitli olabilir.
Bu iletişim kuralı böyle bir donanım diğer dondurma ikame protokolleri ve FIB-SEM veya seri blok-yüz tarama elektron mikroskobu görüntüsü Hall12 tarafından açıklandığı gibi örnekleri farklı türleri ile kombine edilebilir gösterir. Bu görüntüleme teknikleri transmisyon elektron mikroskopi için daha az önemli olan gelişmiş kontrast gerektirir.
The authors have nothing to disclose.
YALAN-SEM ve a.ş. (FIB-SEM operatörü konumunu) küme mükemmellik ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Araştırma Merkezi Nano mikroskobu ve moleküler Fizyoloji beyin (CNMPB) tarafından finanse edilmektedir. Thomas Müller-Reichert laboratuvar C. elegans örnekleri. verdiğiniz için teşekkür ederiz Ulrich Weikert filmde katıldığınız için teşekkür ederiz.
Instrumentation | |||
Leica HPM100 | Leica | ||
Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
EM ACE600 with gold target | Leica | ||
Crossbeam 540 | Zeiss | ||
Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
Oven | VWR | ||
Freezing | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
Forceps | FST | 11200-10 | |
Freeze substitution | |||
Acetone | science services | 10015 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
Acetone | EMS | 10015 | |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
Mounting | |||
SEM stubs | Science Services | E75200 | |
Aclar | Science Services | 50425-10 | |
Toothpicks | |||
filter paper | VWR | 512-3618 | |
conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
Software | |||
Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |