Kütle sitometrisi ile hücresel protein Ifadesinin hücre döngüsü spesifik analizi için Mouse cilt keratinositlerin yalıtım ve boyama
Summary
Bu protokol, deri keratinositlerin fare modellerinden izole edilmesi, metal etiketli antikorlarla lekelenme ve farklı hücre döngüsü aşamalarında ilgi proteinlerinin ifade desenini profil için kitle sitometri tarafından lekelenmiş hücreleri analiz etmek için nasıl açıklar.
Abstract
Bu protokolün amacı, fare derisinin epidermis izolasyonlu tek hücreleri kullanarak bir hücre döngüsüne bağımlı bir şekilde protein ifade değişikliklerini algılamak ve ölçmek için. Yedi önemli adım vardır: dermis epidermis ayrılması, epidermis sindirim, cisplatin ile epidermal hücre nüfus boyama, örnek barkodlama, hücre döngüsü işaretçileri ve proteinleri için metal etiketli antikorlar ile boyama faiz, kütle sitometri tarafından metal etiketli antikorların tespiti, ve çeşitli hücre döngüsü aşamalarında ifade analizi. Histolojik yöntemler üzerinde bu yaklaşımın avantajı, hücre döngüsünün farklı aşamalarında tek bir hücrede > 40 farklı işaretçileri ifade deseni tahlil potansiyeldir. Bu yaklaşım, histolojik/görüntüleme yöntemlerinden daha ölçülebilir olan protein ifadesinin çok değişkenli korelasyon analizine de izin verir. Bu protokolün dezavantajı, tek hücrelerin süspansiyonunun gerekli olduğu, bu da doku bölümlerinin boyama tarafından sağlanan konum bilgilerinin kaybına neden olmaktadır. Bu yaklaşım da ham hücre süspansiyonları farklı hücre türlerini tanımlamak için ek işaretçileri eklenmesi gerektirebilir. Bu protokolün uygulanması hiperplastik cilt hastalığı modellerinin analizinde belirgindir. Dahası, bu protokol, belirli alt tür hücrelerin analizi için uyarlanabilir (örn., kök hücreler), köklere özgü antikorların ilavesi ile. Bu protokol Ayrıca diğer deneysel türlerin cilt hücrelerinin analizi için uyarlanabilir.
Introduction
Gen ifadesinin hücre döngüsü aşamaları ile korelasyon, kanser gibi hiperplastik hastalıkların hayvan modellerinin analizinde bir zorluk olarak kalır. Bu zorluk bir parçası proliferasyon işaretçileri ile ilgi proteinlerinin (POı) ortak algılanması olduğunu. Proliferatif hücreler G1, S, G2 ve M. Ki67 dahil olmak üzere çeşitli hücre döngüsü aşamalarında bulunabilir ve proliferasyon en sık kullanılan belirteçleri biridir ve hücre döngüsünün tüm aşamalarında ifade edilir. Hem insan hem de fare dokularında1,2,3analizinde yaygın olarak kullanılmıştır. Ancak, diğer genel proliferasyon işaretçileri gibi, Ki67 bireysel hücre döngüsü aşamalarını ayırt etmez. Daha hassas bir yaklaşım, bromodeoxyuridine (BrdU) gibi, genomu (örn., S-faz)4,5‘ i aktif olarak çoğalan hücrelere, thymidin nükritit analoglarının birleştirilmesini kullanır. Nükl analoglarının kullanımına yönelik bir dezavantajı, analizden önce hayvanları saatlerce yaşamaları için onları yönetmeniz gerekir. Ki67 ve BrdU genellikle antikor kullanımı ile sabit doku bölümlerinde algılanır. Bu yaklaşımın bir avantajı, POI ‘nin konumunun doku mimarisi içinde (örn. Cilt epidermis bazal tabakası) tespit edilebilir olmasıdır. Bu yaklaşım da gen ifadesinde değişikliklere yol açabilir doku ayrışma gerektirmez. Bir dezavantajı, doku fiktosit veya EKIM dondurulmuş veya parafin sekleme için doku işlenmesi antikor hedefleri (yani, antijenler) okclude olabilir. Antijenlerin alınması genellikle ısı veya doku sindirimi gerektirir. Boyama yoğunluklarını ölçmek de zor olabilir. Bu, boyama, kesit kalınlığı, sinyal algılama ve deney giriş önyargı varyasyonları kaynaklanmaktadır. Dahası, çoğu tipik laboratuar kurulumunda aynı anda sınırlı sayıda Marker tespit edilebilir. Henüz, daha yeni Multiplex boyama yaklaşımlar bu sınırlamaları aşmak için söz; örnekler görüntüleme kütlesi sitometri ve tyramid sinyal amplifikasyon6,7.
Akış cytometri Proliferasyona hücreleri algılamak için başka bir güçlü teknolojidir. Aynı hücrelerde işaretçilerin Multiplex tespiti için izin verir ama çoğu olmayan hematopoetik hücre türleri için doku ayrışma gerektirir. Proliferasyon hücrelerinin analizi, DNA ‘Yı bağlayan boyaların kullanımı ile rutin olarak yapılır (örn., Propidium Iyodide (PI))8. Akış sitometri Ayrıca BrdU kuruluşunda9algılanması ile birleştiğinde hücre döngüsü aşamalarının daha hassas bir şekilde belirlenmesine izin verir. Güçlü bir yaklaşım olsa da, BrdU/PI akış sitometri dezavantajları vardır. Faz spesifik antikorların eklenmesi olmadan G2/M ve G0/G1 aşamalarını çözemeyebilir. Ancak, kullanılabilecek antikorların sayısı hücresel autofluorescence ile sınırlıdır, fluorophore emisyonları spektral yayılma, ve tazminat kontrolleri kullanımı. Bu sınırlama, hücre döngüsü işaretleyicilerinin POI ‘ler ile ifade edilmesini daha zorlu ve zahmetli bir şekilde işaretler. Daha facile bir yaklaşım kitle sitometri10,11kullanmaktır. Bu teknoloji, dar algılama yelpazesine sahip metal konjuge antikorları kullanır. Hücreler metal etiketli antikorlar ile lekelendikten sonra, buharlaştırılmış ve cytometri zaman-of-Flight (CyTOF) kütle spektrometresi tarafından algılanan metaller. Bu özellikler nedeniyle kitle sitometrisi, mevcut platformları10,11kullanarak > 40 farklı işaretçinin Multiplex algılamasını sağlar. Buna ek olarak, numune-Numune boyama değişkenliği azaltarak değerli antikorların tasarrufuna neden metaller ile barkod örnekleri mümkündür. Öte yandan, kitle sitometrisi çeşitli dezavantajları vardır. Non-kan türetilen hücreler için ticari olarak kullanılabilir metal etiketli antikorlar sınırlı sayıda vardır. DNA içeriğinin ölçülme özelliği, floresan DNA boyalarının kullanımına kıyasla daha az hassastır ve kitle sitometri floresan Akış sitometrisi ile karşılaştırıldığında düşük dinamik sinyal algılama aralığına sahiptir.
Burada açıklanan protokol, yeni izole keratinositlerden (KCs) gelen hücre döngüsü dinamiklerini fare derisinden analiz etmek ve kitle sitometrisi kullanarak bu hücrelerde hücre döngüsünün spesifik protein ifadesini karakterize etmek için tasarlanmıştır. Bu protokol aynı zamanda kültürlü hücrelerle de kullanılabilir veya diğer hücre türlerine adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda özetlenen protokol yaklaşık 8 saat içinde tamamlanabilir. Sonuç, hücre döngüsüne bağımlı bir şekilde protein ifadesi için analiz edilebilir KCs zenginleştirilmiş hücrelerin bir süspansiyon olduğunu. Birkaç önceki çalışmalar insan ve fare cilt16,25KCS yalıtmak için yöntemler özetlenmiştir. Bu çalışmalar aynı zamanda akış cytometri26Için KCS izolasyonu için protokoller içerir. Ancak, ayrıntı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu iş için destek, Dermatoloji bölümü, Colorado Üniversitesi ve Colorado Üniversitesi (UC) Cilt Hastalıkları Merkezi Morfoloji ve phenotyping çekirdekleri (NıAMS P30 AR057212) rejeneratif tıp için Gates merkezi geldi. Yazarlar UC Kanser Merkezi akış Cytometri paylaşılan kaynak ve destek Grant (NCı P30 CA046934) kitle sitometrenin çalışması için kabul ve Karen Helm ve Christine Childs için çekirdek akış ve kitle sitometrik üzerinde uzman tavsiyeler için minnettar Teknik.
Materials
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM – Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
References
- Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
- Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
- Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
- Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
- Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
- Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
- Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
- Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
- Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. 癌症研究. 69 (18), 7207-7215 (2009).
- Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).
