本方案的三个关键步骤是：i）开发出具有合适组分和一致性的纤维素水凝胶油墨，ii）将支架3D打印成具有优良形状保真度和尺寸精度的不同孔隙结构，iii）在模拟体内条件下验证其用于软骨再生的力学性能。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
本研究展示了利用三维（3D）打印技术，通过纤维素纳米复合水凝胶油墨制备具有可控孔隙结构和力学性能的多孔立方支架。开发了一种基于纤维素纳米晶体（CNCs，质量分数69.62%）并含有基质（海藻酸钠和明胶）的水凝胶油墨，并将其3D打印成具有均匀及梯度孔隙结构（110–1,100 µm）的支架。在模拟体内条件（37 °C的去离子水中）下测试时，该支架的压缩模量范围为0.20–0.45 MPa。3D支架的孔径大小和压缩模量符合软骨再生应用所需的要求。本研究表明，油墨的一致性可通过前驱体的浓度进行调控，而孔隙率则可通过3D打印工艺控制，这两个因素共同决定了3D打印多孔水凝胶支架的力学性能。因此，该工艺可用于根据患者的具体需求，定制具有特定结构和组分的支架。
引言
纤维素是一种多糖，由线性排列的β(1-4)连接的D-葡萄糖单元组成。它是地球上最丰富的天然聚合物，可从多种来源提取，包括海洋动物（如海鞘）、植物（如木材、棉花、小麦秸秆）以及细菌来源，例如藻类（如绒枝藻）、真菌，甚至变形虫（原生动物）1，2。通过机械处理和酸水解可从纤维素中获得至少有一个维度处于纳米尺度的纤维素纳米纤维（CNF）和纤维素纳米晶体（CNC）。它们不仅具有纤维素的特性，如可进行化学修饰、低毒性、生物相容性、可生物降解性和可再生性，还具备纳米尺度的特征，如高比表面积、优异的力学性能、流变性能和光学性能。这些优异的性能使CNF和CNC适用于生物医学领域，主要以三维（3D）水凝胶支架的形式应用3。这些支架需要具备可控的孔结构和相互连通的孔隙率，并能定制化设计其尺寸。本研究团队及其他研究者已报道了通过浇铸、静电纺丝和冷冻干燥等方法制备的3D多孔纤维素纳米复合材料4，5，6，7，8。然而，这些传统技术尚无法实现对孔结构的精确控制以及复杂几何形状....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 前体的制备
- 纤维素纳米晶体悬浮液的制备
注意：纤维素纳米晶体的分离方法参照 Mathew 等人30 报道的步骤进行。- 通过加入蒸馏水将 17 wt% 的纤维素纳米晶体悬浮液稀释至 2 wt%，总体积为 2 L。使用超声处理充分混合，并采用较小批次（250–300 mL）以实现高效混合。
- 将超声处理后的悬浮液在 500–600 bar 压力下通过均质机处理 10 次。此时可得到 2 wt% 的透明浓稠凝胶状纤维素纳米晶体。
- 通过在 24,500 × g 条件下离心 1.5 小时，将 2 wt% 的纤维素纳米晶体凝胶浓缩至 11 wt%。每离心 30 分钟后倾去上清液。
注意：实验可在此处暂停。
- 基质相的制备
- 在 60 °C 条件下，持续搅拌，制备 6 wt% 海藻酸钠（SA）在蒸馏水中的均一溶液。
- 在 60 °C 条件下，持续搅拌，制备 12 wt% 明胶（Gel）在蒸馏水中的均一溶液。
注意：基质溶液制备 20 mL，储存于冰箱中。
- 交联剂的制备
- 在室温条件下，持续搅拌，制备 3 wt% 氯化钙在蒸馏水中的溶液。
- 在室温条件下....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
基于CNCs的纳米复合水凝胶油墨表现出显著的非牛顿剪切稀化行为（图2a）。在低剪切速率（0.001 s-1）下，其表观黏度为1.55 × 105 Pa·s，当剪切速率增至50 s-1时（≈50 s-1为3D打印过程中典型的剪切速率），黏度下降五个数量级，降至22.60 Pa·s31。该水凝胶油墨表现出黏弹性固体行为，在低剪切应力下，储能模量G’（4.42 × 107 Pa）比损耗模量G’’（8.26 × 106 Pa）高一个数量级，并具有明确的动态屈服应力值（G’=G’’），为5.59 × 104 Pa（图2b）。3D打印的多孔纳米复合水凝胶支架如图3所示。所有打印支架在打印后以及双重交联后均很.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
3D打印需要水凝胶油墨具备合适的流变性能。黏度过高的油墨在挤出时需要极大的压力，而黏度过低的油墨在挤出后无法保持其形状。水凝胶油墨的黏度可通过调节组分浓度进行控制。与我们之前的研究11相比，水凝胶油墨的固含量从5.4 wt%提高至9.9 wt%，形成了更浓缩的油墨，有助于提升打印支架的分辨率。值得注意的是，与长而柔韧的纤维素纳米纤维（CNFs）不同，刚性棒状的纤维素纳米晶体（CNCs）由于不存在物理缠结，可在相同黏度下制备出更高固含量的油墨14。另一个影响可打印性的关键因素是油墨的均一性。研究发现，在40 °C下加热水凝胶油墨可促进CNCs与基质相的均匀混合。为进一步确保水凝胶油墨的平滑性，将其依次通过一系列喷嘴，直径从800 µm开始，随后为600 µm，最终为400 µm。在此过程中，若喷嘴发生堵塞，表明油墨中存在较大团块；经过上述处理后，水凝胶油墨可轻松挤出，形成连续的细丝。喷嘴的运动路径对于获得3D打印结构也至关重要，这一点已在我们先前的研究11中指出。喷嘴路径应避免重复移动和油墨的过度.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由克努特和爱丽丝·瓦伦贝里基金会（Wallenberg Wood 科学 瑞典研究理事会，VR（Bioheal，DNR 2016-05709 和 DNR 2017-04254）
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 60 mL 注射器 | Structur3D Printing | ||
| 海藻酸钠 | Sigma-Aldrich | 9005-38-3 | |
| 无水氯化钙 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| 三叉夹具，Talon 型 | VWR | 241-0404 | 102 mm，双调节夹具，大型，夹具延伸长度 127 mm |
| Cura 2.4.0 | Ultimaker | 免费切片软件 | |
| Discov3ry Complete | Structur3D Printing | 配备 Discov3ry 糊料挤出机的 Ultimaker 2+ 3D 打印机 | |
| 牛皮明胶 | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| 戊二醛溶液，50 wt. % 水溶液 | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| 均质机 | SPX | APV-2000 | |
| Instron 5960 | Instron | Instron 5960，Biopuls 浴槽，100 N 负荷传感器，37 °C | |
| Physica MCR 301 流变仪 | Anton Paar | CP25-2-SN7617，间隙高度 0.05 mm，25 °C | |
| Sorvall Lynx 6000 离心机 | AB Ninolab | s/n 41881692 | F12 转子（6×500 ml） |
| 不锈钢喷嘴 | Structur3D Printing | 800、600 和 400 µm | |
| thingsinverse | MakerBot's | 以 stl 文件格式共享和下载可打印 3D 模型的平台 | |
| 超声处理 | Qsonica, LLC | Q500 | |
| 去皮木片 | 挪威云杉（Picea abies） | 干物质含量为 50–55% |
参考文献
- Moon, R. J., Martini, A., Nairn, J., Simonsen, J., Youngblood, J. Cellulose nanomaterials review: structure, properties and nanocomposites. Chemical Society Reviews. 40 (7), 3941-3994 (2011).
- Dufresne, A. Nanocellulose: a new ageless bionanomaterial. Materials Today.....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
