عزل جزيئات البروتين الدهني من صفار بيض الدجاج لدراسة دمج الأحماض الدهنية المسببة للأمراض البكتيرية في الدهون الفوسفاتية الغشاء
Summary
توفر هذه الطريقة إطارا لدراسة دمج الأحماض الدهنية الخارجية من المصادر المضيفة المعقدة في الأغشية البكتيرية ، وخاصة المكوراتالعنقودية العضوية . ولتحقيق ذلك، يتم وصف بروتوكولات لإثراء جزيئات البروتين الدهني من صفار بيض الدجاج وتوصيف الأحماض الدهنية اللاحقة للفوسفوليبيدات البكتيرية باستخدام قياس الطيف الكتلي.
Abstract
المكورات العنقودية أوريوس وغيرها من مسببات الأمراض إيجابية الجرام دمج الأحماض الدهنية من البيئة في فوسفوليبيدات الغشاء. خلال العدوى ، توجد غالبية الأحماض الدهنية الخارجية داخل جزيئات البروتين الدهني المضيف. ولا يزال عدم اليقين قائما فيما يتعلق بخزانات الأحماض الدهنية المضيفة والآليات التي تستخرج بها البكتيريا الأحماض الدهنية من جزيئات البروتين الدهني. في هذا العمل، ونحن نصف بروتوكولات لإثراء البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) جزيئات من صفار البيض الدجاج وتحديد ما إذا كانت LDLs بمثابة خزانات الأحماض الدهنية لS. aureus. هذا الأسلوب يستغل تحليل الدهون غير متحيزة وLDLs الدجاج، وهو نموذج فعال واقتصادي لاستكشاف التفاعلات بين LDLs والبكتيريا. يتم إجراء تحليل S. aureus التكامل من الأحماض الدهنية الخارجية من LDLs باستخدام عالية الدقة / قياس الطيف الكتلي الدقيق والقياس الطيفي الكتلي جنبا إلى جنب، مما يتيح توصيف تكوين الأحماض الدهنية للبكتيريا غشاء وتحديد غير متحيزة من تركيبات جديدة من الأحماض الدهنية التي تنشأ في الدهون الغشاء البكتيري عند التعرض لLDLs. تقدم هذه التقنيات المتقدمة لقياس الطيف الكتلي منظورًا لا مثيل له لدمج الأحماض الدهنية الدهنية من خلال الكشف عن الأحماض الدهنية الخارجية المحددة المدمجة في الدهون الفوسفاتية. الطرق المبينة هنا قابلة للتكيف مع دراسة مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى والمصادر البديلة للأحماض الدهنية المعقدة.
Introduction
Methicillin مقاومة S. aureus (MRSA) هو السبب الرئيسي للعدوى المرتبطة بالرعاية الصحية ومقاومة المضادات الحيوية المرتبطة بها هو تحد سريري كبير1،2،3. ولذلك، فإن وضع استراتيجيات علاجية جديدة هو أولوية عالية. استراتيجية العلاج واعدة لمسببات الأمراض إيجابية الجرام هو تثبيط تخليق الأحماض الدهنية، وهو شرط لإنتاج الدهون الفوسفاتية الغشاء الذي، في S. أوريوس،ويشمل فوسفاتيديلغليسيرول (PG)، ليسل-PG، وcardiolipin4. في البكتيريا، يحدث إنتاج الأحماض الدهنية عن طريق التخليق الأحماض الدهنية الثاني المسار (FASII)5، والذي يختلف اختلافا كبيرا عن نظيره eukaryotic، مما يجعل FASII هدفا جذابا لتطوير المضادات الحيوية5،6 . مثبطات FASII تستهدف في المقام الأول FabI، وهوإنزيم مطلوب لاستطالة سلسلة الكربون الأحماض الدهنية 7. يستخدم على نطاق واسع مثبطات فابي التريكلوسان في السلع الاستهلاكية والطبية8،9. ويجري تطوير مثبطات FabI إضافية من قبل العديد من شركات الأدوية لعلاج عدوى S. aureus 10،11،12،13،14 ،15،16،17،18،19،20،21،22،23 ،24،25،26. ومع ذلك، العديد من مسببات الأمراض إيجابية غرام، بما في ذلك S. aureus،قادرة على مسح الأحماض الدهنية الخارجية لتخليق الدهون الفوسفاتية، وتجاوز تثبيط FASII27،28،29. وهكذا، يتم مناقشة الإمكانات السريرية لمثبطات FASII بسبب وجود ثغرات كبيرة في معرفتنا بمصادر الأحماض الدهنية المضيفة والآليات التي تقوم بها مسببات الأمراض باستخراج الأحماض الدهنية من المضيف27،28. لمعالجة هذه الثغرات، قمنا بتطوير طريقة تحليل الدهون غير متحيزة لرصد دمج الأحماض الدهنية الخارجية من جزيئات البروتين الدهني في فوسفوليبيدات الغشاء من S. aureus.
أثناء الإنتان ، تمثل جزيئات البروتين الدهني المضيف مصدرا محتملا للأحماض الدهنية المشتقة من المضيف داخل الأوعية الدموية ، حيث ترتبط غالبية الأحماض الدهنية المضيفة بالجسيمات30. تتكون البروتينات الدهنية من قشرة مائية تتكون من الدهون الفوسفاتية والبروتينات التي تحيط بجوهر الكاره للماء من الدهون الثلاثية واسترات الكوليسترول31. يتم إنتاج أربع فئات رئيسية من البروتينات الدهنية – الهيلوميكرون، والبروتين الدهني منخفض الكثافة، والبروتين الدهني عالي الكثافة، والبروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) – من قبل المضيف وتعمل كمركبات نقل للدهون، وتقديم الأحماض الدهنية والكوليسترول من وإلى الخلايا المضيفة عبر الأوعية الدموية. LDLs وفيرة في الأحماض الدهنية استيريفيد بما في ذلك الدهون الثلاثية واسترات الكوليسترول31. لقد أثبتنا في السابق أن LDLs البشرية عالية النقاء هي مصدر قابل للحياة من الأحماض الدهنية الخارجية لتخليق PG، وبالتالي توفير آلية لمثبطات FASII الالتفافية32. يمكن أن يكون تنقية LDLs البشرية صعبة من الناحية الفنية وتستغرق وقتاً طويلاً في حين أن المصادر التجارية لـ LDLs البشرية النقية مكلفة للغاية للاستخدام على أساس روتيني أو لأداء شاشات بكتيرية واسعة النطاق. لمعالجة هذه القيود، قمنا بتعديل إجراء لإثراء LDLs من صفار البيض الدجاج، وهو مصدر غني من جزيئات البروتين الدهني33. لقد استخدمنا بنجاح غير مستهدفة، عالية الدقة / قياس الطيف الكتلي الدقيق والقياس الطيفي الكتلي جنبا إلى جنب لرصد دمج الأحماض الدهنية المستمدة من LDL الإنسان في غشاء S. aureus32. على عكس الأساليب التي تم الإبلاغ عنها سابقا، يمكن لهذا النهج تحديد أيزومرات الأحماض الدهنية الفردية لكل من أنواع فوسفوليبيد المكورات العنقودية الرئيسية الثلاثة. حمض الأوليك (18:1) هو حمض دهني غير مشبع موجود داخل جميع جزيئات البروتين الدهني المضيف التي يتم دمجها بسهولة في S. aureus phospholipids29،30،32. S. aureus ليست قادرة على توليف حمض الأوليك29; ولذلك، فإن كمية حمض الأوليك المدرجة فوسفوليبيد يثبت وجود الأحماض الدهنية المشتقة من البروتين الدهني المضيف داخل غشاء المكورات العنقودية29. ويمكن تحديد هذه الأنواع الفوسفاتية من خلال أحدث طريقة قياس الطيف الكتلي الموصوفة هنا، وتقدم دقة غير مسبوقة لتكوين غشاء S. aureus المستزرعة في وجود مصدر الأحماض الدهنية فمن المرجح المواجهات أثناء العدوى.
Protocol
Representative Results
Discussion
S. aureus يدمج الأحماض الدهنية الخارجية في الدهون الفوسفاتية غشاء27،32،43. تركيب فوسفوليبيد باستخدام الأحماض الدهنية الخارجية يتجاوز تثبيط FASII ولكن أيضا يغير الخصائص البيوفيزيائية للغشاء27،32،<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبر هامر على تقييمهم النقدي للمخطوطة ودعمهم لهذا العمل. الدكتور أليكس هورسويل من كلية الطب بجامعة كولورادو يرجى تقديم AH1263. قدم الدكتور كريس ووترز مختبر في جامعة ولاية ميشيغان الكواشف. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية منحة 16SDG30170026 والأموال الناشئة التي تقدمها جامعة ولاية ميشيغان.
Materials
| Ammonium sulfate | Fisher | BP212R-1 | ≥99.5% pure |
| Cell culture incubator | Thermo | MaxQ 6000 | |
| Centrafuge | Thermo | 75-217-420 | Sorvall Legen XTR, rotor F14-6×250 LE |
| Costar assay plate | Corning | 3788 | 96 well |
| Filter paper | Schleicher & Schuell | 597 | |
| Large chicken egg | N/A | N/A | Common store bought egg |
| Microplate spectrophotometer | BioTek | Epoch 2 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| S. aureus strain AH1263 | N/A | N/A | Provided by Alex Horswill of the University of Colorado |
| Dialysis tubing | Pierce | 68700 | 7,000 MWCO |
| Tryptone | Becton, Dickison and Company | 211705 | |
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24B | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A4561 | |
| Chloroform (reagent grade) | Fisher | MCX10559 | |
| Isopropanol (LC-MS grade) | Fisher | A4611 | |
| Dimyristoyl phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850345C-25mg | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | ≥99.5% pure |
| Ammonium formate | Sigma | 70221-25G-F | |
| Xcalibur software | Thermo Scientific | OPTON-30801 | |
| LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Scientific | high resolution/accurate mass MS | |
| Agilent 1260 capillary HPLC | Agilent | ||
| SpeedVac Vacuum Concentrators | Thermo Scientific |
References
- Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
- Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
- Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
- Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
- Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
- Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
- Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
- Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
- Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
- Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
- Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
- Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
- Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
- Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
- Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
- Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
- Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
- Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
- Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
- Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
- Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
- Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
- Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
- Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
- Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
- Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
- Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
- Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
- Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
- Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
- Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
- Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
- Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
- Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
- Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
- Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
- Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
- Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
- Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
- Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
- Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
- Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
- Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
- Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
- Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
- Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
- Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts – Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
- Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
- Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).
