通过免疫荧光法对非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞进行半自动PD-L1表征与计数

摘要

循环肿瘤细胞（CTC）的表征是转化研究中的一个热门课题。本方案描述了一种半自动免疫荧光（IF）检测方法，用于对非小细胞肺癌（NSCLC）患者样本中的CTC进行PD-L1表征及计数。

摘要

源自原发性肿瘤的循环肿瘤细胞（CTCs）会脱落进入血液或淋巴系统。这些稀有细胞（每毫升血液中仅含1−10个）提示预后不良，并与多种癌症（如乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌）的总体生存期缩短相关。目前，基于抗EpCAM包被的磁珠捕获CTC的系统是美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于计数血液中CTC的金标准检测方法。该检测利用包被有抗EpCAM标记物的磁珠，特异性靶向上皮来源的癌细胞。许多研究表明，EpCAM并非CTC检测的最佳标志物。事实上，CTC是具有异质性的癌细胞亚群，能够经历与转移性增殖和侵袭相关的上皮-间质转化（EMT）。这些CTC可降低细胞表面的上皮标志物EpCAM的表达，同时增加波形蛋白（vimentin）等间质标志物的表达。为克服这一技术难题，研究人员已开发出基于CTC物理特性的其他分离方法。微流控技术可实现无需标记的CTC富集，从全血样本中分离CTC。螺旋式微流控技术利用惯性力和Dean拖曳力，在螺旋微流控芯片内的弯曲通道中形成连续流动，根据正常血细胞与肿瘤细胞在大小和可塑性上的差异实现细胞分离。本实验方案详细描述了结合螺旋式微流控装置与可定制的免疫荧光（IF）标志物组合，对CTC中程序性死亡配体1（PD-L1）表达进行表征的各项步骤。

引言

肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）通过一种称为癌症"免疫监视"的过程，在抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用。免疫检查点阻断抗体（如CTLA-4抑制剂和PD-1/PD-L1抑制剂）可增强CTLs的抗肿瘤功能。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，抗PD-1/PD-L1治疗在PD-L1阴性肿瘤患者中的应答率为0%-17%，而在PD-L1阳性表达患者中则为36%-100%。黑色素瘤和非小细胞肺癌中对PD-1/PD-L1阻断治疗的显著应答已有充分证据，表现为总体应答率（RR）提高、持久的临床获益以及无进展生存期（PFS）延长。目前，在二线治疗中，无论PD-L1表达水平如何，纳武利尤单抗（nivolumab）均为NSCLC的标准治疗方案；而对于PD-L1表达≥1%的患者，帕博利珠单抗（pembrolizumab）也是标准选择。在一线治疗中，对于PD-L1表达≥50%的NSCLC患者，单独使用帕博利珠单抗是标准治疗方案，并可根据组织学亚型联合化疗（铂类药物与双药组合）以进一步增强疗效^1,2。

然而，这种患者管理方法存在争议³，因为通过免疫组织化学（IHC）检测肿瘤细胞中的PD-L1表达可能并非最理想的伴随生物标志物。其他标志物如肿瘤突变负荷⁴（TMB）、微卫星不....

方案

样本在里昂大学医院的CIRCAN（"CIRculating CANcer"）队列研究框架内，根据患者的书面知情同意，前瞻性地收集。本研究纳入CIRCAN_ALL队列。CIRCAN_ALL研究已于2015年4月11日由法国东南部第四伦理审查委员会（CPP South-East IV）认定为非干预性研究，编号L15-188；其修订版本于2016年9月20日以编号L16-160再次被认定为非干预性研究。CIRCAN_ALL研究已于2015年12月1日向里昂市立医院（Hospices Civils de Lyon）的信息技术与自由事务代表完成申报，申报编号为15-131。血液采集在临床医生观察到肿瘤进展的最早迹象时进行。

注意：请使用材料表中列出的所有试剂和材料，并按照相应的储存条件进行分析前样本制备和免疫荧光检测。替换试剂和/或修改储存条件可能导致检测性能不理想。

1. 螺旋微流控装置的去污染

注意：螺旋微流控装置的去污染是必要的步骤，旨在去除由细菌污染产生的所有免疫荧光背景，以便观察循环肿瘤细胞（CTC）的细胞形态学特征，并能够将其与正常免疫细胞区分开来。本方案已针对在采血后6小时内采集于K₂EDTA管中的血液样本进行优化，并在洁净条件....

结果

首要前提条件是获得无污染（无病原体）的循环肿瘤细胞（CTC）样本用于组织培养，并避免产生免疫荧光背景信号。去污染方案能够清洁所有管道和泵，从而以较高的回收率收集到无细菌污染的CTC。通过螺旋微流控装置，比较了采用与不采用去污染流程的富集样品。为验证去污染方案的有效性，使用A549细胞系在无全血存在的情况下直接通过螺旋微流控装置进行富集。若未采用优化后的去污染方案，在富集后的A549细胞系组织培养中仅24小时即观察到严重的细菌污染，导致真核细胞死亡及细胞形态学改变（图1B）。

相比之下，在清洗方案处理后，通过组织培养和培养基去除10小时后，在二维培养条件下以及三维条件下均获得了存活的A549细胞（图1B），同时也获得了患者样本（图1C）。潜在的循环肿瘤细胞以红色叉号标记（

讨论

本研究提出了两个主要问题，第一个涉及工作流程在临床应用转化中的表现，第二个涉及所获得荧光图像分析中主观性的降低。

通过CTC无标记微流控系统（螺旋微流控装置）富集细胞后，采用可定制的免疫荧光检测方法，初步确定了一种高效且优化的CTC计数工作流程。利用该工作流程，一项初步研究证实，所有转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者的样本中均存在非典型细胞，且均为CD45阴性[CD45(-)]。这些细胞可选择性地表达上皮细胞角蛋白（PanCK）和/或PD-L1生物标志物；但也可能对所有检测的生物标志物均呈阴性[即CD45(-)、PanCK(-)和PD-L1(-)，如S19样本中所观察到的（表2）]。这一发现突出表明，亟需增加可用于CTC亚群表型鉴定的其他生物标志物。因此，建议增加上皮-间质转化相关生物标志物，如EpCAM、波形蛋白（Vimentin）和N-钙黏蛋白（N-Cadherin）；癌症干细胞标志物，包括CD44和CD133；以及特定肿瘤标志物，如肺腺癌中的TTF1。

在初步研究中，3.5 mL 全血.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4',6-二脒基-2-苯并咪唑酮é尼林哚（DAPI）	Ozyme	BLE 422801	储存条件：+4 °C
BD Facs Clean – 5 L	BD Biosciences	340345	基于漂白剂的清洁剂。储存条件：室温
1% 次氯酸钠清洗液 100 mL	Biolidics	CBB-F016012	漂白剂。储存条件：室温
牛血清白蛋白（BSA）7.5%	Sigma	A8412	储存条件：+4 °C
CD45单克隆抗体（克隆HI30）Alexa Fluor 647	BioLegend	BLE304020	储存条件：+4 °C
CellProfiler 软件	布罗德研究所		图像分析软件
离心装置	Hettich	4706	储存条件：室温
50 mL 离心管	康宁	430-829	储存条件：室温
15 mL 离心管	Biolidics	CBB-F001004-25	储存条件：室温
ClearCell FX-1 系统	Biolidics	CBB-F011002	螺旋微流控装置。储存条件：室温
库尔特克伦茨清洗剂 – 5 L	贝克曼库尔特	8448222	通用清洁试剂。储存条件：室温
CTChip FR1S	Biolidics	CBB-FR001002	微流控芯片。储存条件：室温
Cytospin 4	赛默飞世尔科技	A78300003	储存条件：室温
稀释液添加剂试剂 – 20 mL	Biolidics	CBB-F016009	储存条件：+4 °C
EZ 细胞进样槽	赛默飞世尔科技	A78710003	带有棉絮的样本室。储存条件：室温
FcR阻断剂	Miltenyi Biotec	130-059-901	储存条件：+4 °C
胎牛血清（FCS）	Gibco	10270-106	储存条件：+4 °C
Fluoromount	Sigma	F4680	封片液。储存条件：室温
两性霉素B - 50 mg	百时美施贵宝	90129TB29	抗真菌试剂。储存条件：+4 °C
FX1 输入管（带锁紧盖）	Biolidics	CBB-F013005	稻草。储存条件：室温
KovaSlide	Dutscher	50126	带腔载玻片。储存条件：室温
PanCK单克隆抗体（克隆AE1/AE3）Alexa Fluor 488	赛默飞世尔科技	53-9003-80	储存条件：+4 °C
16% 多聚甲醛	赛默飞世尔科技	11490570	固定液。储存条件：+4 °C
PD-L1 单克隆抗体（克隆号 29E2A3）- 藻红蛋白	BioLegend	BLE329706	储存条件：+4 °C
培养皿	Dutscher	632180	储存条件：室温
磷酸盐缓冲液（PBS）	Ozyme	BE17-512F	储存条件：+4 °C
超纯级磷酸盐缓冲液 1x – 1 L	1st Base 实验室	BUF-2040-1X1L	储存条件：室温
Pluronic F-68 10%	Gibco	24040-032	抗结合溶液。储存条件：室温
多聚赖氨酸载玻片	赛默飞世尔科技	J2800AMNZ	储存条件：室温
50 mL 聚丙烯圆锥形离心管	Falcon	352098	储存条件：室温
红细胞裂解缓冲液 – 100 mL	G Biosciences	786-649	储存条件：+4 °C
红细胞裂解缓冲液 – 250 mL	G Biosciences	786-650	储存条件：+4 °C
重悬缓冲液（RSB）	Biolidics	CBB-F016003	储存条件：+4 °C
Shandon Cytopsin4 离心机	ThermoFisher	A78300003	专用离心机。储存条件：室温
硅基隔离器	Grace bio-Labs	664270	储存条件：室温
无菌去离子水 – 100 mL	1st Base 实验室	CUS-4100-100ml	储存条件：室温
直立荧光显微镜 Axio Imager D1	Zeiss		储存条件：室温
无菌手术袋	SPS Laboratoires	98ULT01240	储存条件：室温
20 mL 无菌注射器 BD Discardit II	BD 生物科学	300296	储存条件：室温
0.22 微米注射器滤器 µm 33 mm 无菌	ClearLine	51732	储存条件：室温
Zen lite 2.3 软件	Zeiss		显微镜配套软件