利用自动化图像处理分析裂殖酵母和芽殖酵母中的脂滴含量

摘要

本文介绍了一种基于 MATLAB 的自动化检测方法，用于对裂殖酵母和芽殖酵母细胞荧光显微镜图像中的脂滴进行定量描述。

摘要

脂质代谢及其调控是基础生命科学、应用生命科学和生物技术领域共同关注的重要课题。在这一领域中，多种酵母物种被用作脂质代谢研究的模型或用于工业级脂质生产。脂滴是高度动态的储存结构，其细胞内含量可作为反映脂质代谢状态的便捷指标。荧光显微镜技术是定量分析细胞内脂滴的首选方法，因其依赖于广泛可用的设备，并能够对单个脂滴进行分析。此外，显微图像分析可实现自动化，从而显著提高整体分析通量。本文介绍了一种针对三种模式酵母物种中单个脂滴进行自动检测与定量描述的实验与分析工作流程，这三种酵母分别为裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe和Schizosaccharomyces japonicus，以及芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae。使用BODIPY 493/503对脂滴进行荧光标记，同时在培养基中添加细胞不可渗透的荧光葡聚糖，以帮助识别细胞边界。细胞在绿色和蓝色通道中接受三维落射荧光显微成像，所得的z轴层扫图像由MATLAB分析流程自动处理。该流程输出以表格形式呈现的丰富定量数据，包括细胞内脂滴含量及单个脂滴的特征参数，适用于主流电子表格软件或统计分析软件的后续分析。我们还提供了在不同影响细胞脂质代谢条件下脂滴含量的示例分析。

引言

脂质在细胞能量代谢和碳代谢、膜组分的合成以及生物活性物质的生成中发挥着关键作用。脂质代谢会根据环境条件、营养物质的可利用性以及细胞周期阶段进行精细调控¹。在人类中，脂质代谢与肥胖、2型糖尿病和癌症等疾病密切相关²。在工业领域，由酵母等微生物产生的脂质被视为一种有前景的可再生柴油燃料来源³。细胞将中性脂质储存在所谓的脂滴（LDs）中。这些在进化上保守的结构由三酰甘油、甾醇酯、外层的磷脂单层以及相关蛋白组成¹。脂滴起源于内质网，表现出随细胞周期或生长阶段变化的动态特征，并在细胞脂质稳态中发挥重要作用¹。在不同生长条件下检测脂质代谢或筛选突变体时，脂滴的数量和形态可作为便捷的替代指标。鉴于脂滴具有高度动态的特性，能够分析单个脂滴特性的技术在脂质代谢研究中尤其受到关注。

多种酵母物种已被用于描述脂质相关代谢途径及其调控机制，或在生物技术中用于生产有价值的化合物或燃料¹。此外，对于模式酵母，如芽殖酵母 Saccharomyces cerevisiae 或进化关系较远的裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe，已有全基因组敲除菌株文库可供用于高通量筛....

方案

1. 溶液与培养基的制备

1. 配制脂质染色液。
   1. 配制脂质染色储备液：将10 mg BODIPY 493/503溶解于10 mL无水DMSO中（终浓度为1 mg/mL）。建议将整瓶10 mg的BODIPY 493/503全部溶解，以避免称量过程中样品损失。
      注意：DMSO可经皮肤吸收。操作时请穿戴适当的个人防护装备。
   2. 通过将100 µL的1 mg/mL BODIPY 493/503储备液与900 µL无水DMSO混合，配制工作用脂质染色液（终浓度为0.1 mg/mL）。
   3. 将储备液和工作液分装后，于-20 °C保存。
      注意：溶解后的BODIPY 493/503在-20 °C下可稳定保存数年，但需避光并防止受潮。
2. 为细胞边界可视化配制储备液：将整瓶25 mg级联蓝葡聚糖（Cascade Blue dextran）溶于2.5 mL去离子水中（终浓度为10 mg/mL）。将储备液分装后，避光保存于-20 °C。
3. 为显微镜载玻片包被液配制溶液：将5 mg大豆凝集素溶于5 mL去离子水中（终浓度为1 mg/mL）。将凝集素溶液分装后，保存于-80 °C。
   注意：凝集素溶液在-80 °C下可稳定保存数年；正在使用的分装样品可短....

结果

整个过程总结如下 图1 适用于裂殖酵母（芽殖酵母的工作流程类似），下文提供了如何利用该工作流程在已知影响细胞脂滴含量的不同条件下，研究三种不同酵母物种中脂滴含量的示例。每个示例代表一次独立的生物学实验。

图1：实验与分析工作流程的示意图。 以裂殖酵母为例展示该工作流程。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

了解脂质代谢及其调控机制对于基础生物学以及临床和生物技术应用都具有重要意义。脂滴（LD）含量是反映细胞脂质代谢状态的一个便捷指标，其中荧光显微镜是测定脂滴含量的主要方法之一。本方案可实现对三种不同且形态各异的酵母物种中单个脂滴的自动检测与定量描述。据我们所知，目前尚无针对裂殖酵母的类似工具。用于图像处理的 MATLAB 脚本作为补充文件提供，同时也可通过 Figshare 数据库获取（DOI 10.6084/m9.figshare.7745738），其中包括本文所有的原始和处理后的图像数据及表格数据、CSV 输出文件的详细说明，以及用于下游数据分析和可视化的 R 脚本。此外，最新版本的 MATLAB 脚本也可从 GitHub 获取（https://github.com/MartinSchatzCZ/LipidDots-analysis）。

成功的脂滴（LD）分析在很大程度上依赖于所获得的原始荧光图像的质量。为了使分割算法达到最佳性能，显微镜观察应使用无尘的洁净玻璃载片，细胞应形成单层（每个视野中的实际细胞数量并非关键参数），且不应含有大量死细胞。此外，z轴层析成像应从细胞焦平面略下.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 位单色 CCD 相机 Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG	Hamamatsu		或同等产品
腺嘌呤半硫酸盐，≥99%	Merck	A9126-25G
BODIPY 493/503（4,4-二氟-1,3,5,7,8-五甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚并）	Thermo Fisher Scientific	D3922	用于中性脂质染色
D-(+)-葡萄糖，≥99.5%	Merck	G7021
葡聚糖，级联蓝，分子量 10,000，阴离子型，可与赖氨酸交联固定	Thermo Fisher Scientific	D1976	用于细胞负染色
二甲基亚砜，≥99.5%	Merck	D4540	或更高纯度，保存于分子筛中以保持无水状态
不含葡萄糖的 EMM 培养基	Formedium	PMD0405	也可由单一组分自行配制培养基
Fiji/ImageJ 软件	NIH		或同等软件；用于显微图像数据的目视检查
高精度盖玻片，22 mm × 22 mm，1.5 号	VWR	630-2186	可使用任何 1.5 号盖玻片
MATLAB 图像处理工具箱，版本 10.0	Mathworks
大豆凝集素（Glycine max 来源）	Merck	L1395	用于细胞在载玻片上的固定
MATLAB 软件，版本 9.2	Mathworks
显微镜载玻片，26 mm × 76 mm，厚度 1 mm	Knittel Glass	L762601.2	使用适配显微镜载物台的任意载玻片，接种细胞前需彻底清洗
配备自动 Z 轴物镜移动功能的 Olympus CellR 显微镜	Olympus		或同等设备
五通道滤光片组	Semrock	F66-985	明场、绿色和蓝色通道已足够
MATLAB 信号处理工具箱，版本 7.4	Mathworks
SP 补充剂	Formedium	PSU0101
可运行 MATLAB 的普通办公计算机
MATLAB 统计与机器学习工具箱，版本 11.1	Mathworks
微生物学用通用蛋白胨 M66	Merck	1070431000
UPLSAPO 60XO 物镜	Olympus		或同等物镜
酵母提取物	Formedium	YEA03
不含氨基酸的酵母氮源基础	Formedium	CYN0405