通过追踪阿拉伯植物双重受精中的精子核形态对受精国的评价

Summary

我们演示了一种利用荧光显微镜在阿拉伯拟南芥中精子核形态测定成功或失败受精的方法。

Abstract

开花植物有一个独特的性生殖系统，称为"双受精"，其中每个精子细胞精确与卵细胞或中心细胞融合。因此，两个独立的受精事件几乎同时发生。受精卵细胞和中枢细胞分别发育成酶和内膜。因此，精确控制双施肥对后续种子发育至关重要。双重受精发生在雌性野味（胚胎囊），这是深隐藏，覆盖着厚厚的卵巢和卵巢组织。这种双倍施肥的构造使得对双施肥的观察和分析相当困难，造成了目前双施肥机制问题仍未解决的局面。对于施肥调节器潜在候选者的功能评估，施肥的体称分析非常重要。为了判断在阿拉伯拟南芥中受精的完成情况，用标记精子核的荧光信号的形状作为指标。未能受精的精子细胞由雌性配子外的凝聚荧光信号指示，而成功受精的精子细胞则通过与雌性配子核的结核核的减压信号表示。此处描述的方法提供了一个工具，用于确定在体内条件下成功或失败的受精。

Introduction

开花植物通过双重受精产生种子，这个过程由在Gamete血浆膜1、2上局部的蛋白质之间的相互作用直接控制。开花植物雄性配子，一对精子细胞，在花粉中发育。授粉后生长的花粉管将一对精子细胞输送到雌性配子、卵细胞和中心细胞，这些细胞在胚胎囊中发育。雄性配子和雌性配子相遇后，配子表面的蛋白质促进识别、附着和融合，以完成双重受精。在以前的研究中，雄性Gamete膜蛋白:2（GCS1）/HAPLESS2（HAP2）3、4和GAMETE表达2（GEX2）5被确定为参与Gamete融合的受精调节剂，附件。我们最近鉴定出一种雄性gamete特异性膜蛋白，DUF679 DOMAIN，第9蛋白（DMP9），作为参与Gamete相互作用的受精调节剂。我们发现，DMP9表达的减少导致在A.thaliana⁶的双重受精期间对卵细胞受精的显著抑制。

由于双受精发生在胚胎囊中，胚胎囊嵌入在卵巢组织进一步包裹的卵子中，因此很难观察和分析双重受精过程状态。因此，仍有许多不明确的点，阻碍对双施肥控制的整体机制的全面了解。建立观察技术，以跟踪在体内条件下的....

Protocol

1. 人工授粉

注:在开始该过程之前，需要一对 5 号钳子。

1. 在生长室的16-h光/8-h暗循环下，在22°C下生长A.thaliana（Col-0）。
   注:用剪刀切割和去除第一个开发的花茎，以促进开枝芽的发展。大力种植植物（切割第一茎后2-3周;植物高度约25厘米）适合分析。
2. 要削弱花蕾（图1B）、花瓣（图1C）和花蕾（图1D），使用第5号钳子（图1A）。。在顶部看到花瓣的芽是最好的。
   注:使用合适的女性游戏标记线。在这个协议中，我们使用野生植物作为雌性父。
3. 消瘦后十五至十八小时，在阶段 13⁸时用钳子捏住灯丝，取取DMP9^{KD/HTR10-mRFP}花的摇号。
4. 要授粉，轻轻拍打一个被污辱的污名几次与脱皮器。

Results

用DMP9 KD/HTR10-mRFP授粉的皮斯蒂尔的卵泡在7-8HAP上被收集并观察。

大多数卵泡在卵细胞（微皮侧）和中细胞（夏拉扎尔端侧）的细胞核位置分别含有两个解压缩的mRFP标记精子核（图3A），表明成功的双重受精。此外，在中心细胞核处观察到含有解压缩mRFP标记精子核的卵子，以及卵细胞外的凝结mRFP标记精子核（图3B），表明单受精。在双受精失败的情况下，在卵细胞和中心细胞的边界处观察到两个浓缩的mRFP标记精子核（图3C），如gcs1突变精子细胞（图3D）3，4

Discussion

HTR10-mRFP标签父色素（即，可视化精子细胞核），和动态在双受精已报告7。从花粉管中释放后，HTR10-mRFP标记的精子核仍然凝结。然而，每个精子核在与受精的雌性体细胞核合并后，在Gamete膜^融合7后三到四个小时被解压缩。未受精的精子细胞保持浓缩，如在胚胎囊中所示，在胚胎囊中gcs1精子细胞在没有受精的情况下被吸收（图3D）。通常，当肥的HTR10-mRFP用作花粉母时，57.9%~17.8%（均值= s.d.;n = 16分），在7-8 HAP的卵子中含有两个mRFP标记的精子核信号，以及几乎所有的信号（97.2%）解压缩，反映成功的双重受精（类似的信号模式如图3A所示）。在DMP9^{KD/HTR10-mRFP}的情况下，观察到含有两个mRFP标记精子核的卵子，其频率与HTR10-mRFP相似，但其中1.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BX51	奥林巴斯		落射荧光显微镜
盖玻片	松波玻璃	C018181
DMP9KD/HTR10-mRFP			拟南芥， HTR10-mRFP背景 Takahashi 等人 （2018）6
双面胶带	Nichiban	NW-15S	15 mm 宽
DP72	Olympus		Degital 相机
镊子	Vigor		任何 5 号镊子可用
生长室	Nihonika	LPH-411PFQDT-SP
HTR10-mRFP<			em>拟南芥，生态型 Columbia-0 （Col-0） 背景 Ingouff 等人。2007）7
注射针	Terumo	NN-2719S	27 G
载玻	片 松波玻璃	S9443
SZX9	林巴斯		解剖显微镜
U-MRFPHQ	奥林巴斯		荧光滤光片立方体 （激发：BP535-555，发射：BA570-625，重色镜：DM565）
UPlanFL N 40x	奥林巴斯		物镜 （NA 1.3），油浸
式 UPlanSApo 20x	奥林巴斯		物镜 （NA 0.75），干式