Immunoglobulin G N-Glycan Analisi di Ultra-Performance Liquid Chromatoography
Summary
ImmunoglobulinG (IgG) N-glican è caratterizzato utilizzando l’interazione idrofila cromatografica UPLC. Inoltre, la struttura di IgG N-glycan è chiaramente separata. Presentato qui è un’introduzione a questo metodo sperimentale in modo che possa essere ampiamente utilizzato nelle impostazioni di ricerca.
Abstract
Il glicomics è una nuova sottospecializzazione nella ricerca sul sistema omico che offre un potenziale significativo nella scoperta di biomarcatori di nuova generazione per la suscettibilità alle malattie, la scoperta di bersagli farmacologici e la medicina di precisione. I iggini alternativi IgG Nsono stati riportati in diverse malattie croniche comuni e hanno suggerito di avere un grande potenziale nelle applicazioni cliniche (ad esempio, biomarcatori per la diagnosi e la previsione delle malattie). IgG N-glicani sono ampiamente caratterizzati utilizzando il metodo di cromatografia di interazione idrofila (HILIC) cromatografia liquida ad altissima prestazione (UPLC). UPLC è una tecnologia di rilevamento stabile con una buona riproducibilità e un’elevata precisione quantitativa relativa. Inoltre, la struttura di IgG N-glycan è chiaramente separata, e la composizione glicana e l’abbondanza relativa nel plasma sono caratterizzati.
Introduction
N-glicosilazione delle proteine umane è una modifica post-traduzionale comune ed essenziale1 e può aiutare a prevedere l’insorgenza e lo sviluppo di malattie in modo relativamente accurato. A causa della complessità della sua struttura, si prevede che ci siano più di 5.000 strutture glicane, fornendo un grande potenziale come biomarcatori diagnostici e predittivi per le malattie2. N-glicani attaccati all’immunoglobulina G (IgG) hanno dimostrato di essere essenziali per la funzione di IgG, e IgG N-glycosylation partecipa all’equilibrio tra i sistemi pro e antinfiammatori3. La legatura IgG Ndifferenziale è coinvolta nello sviluppo e nella progressione della malattia, che rappresenta sia una predisposizione che un meccanismo funzionale coinvolto nella patologia della malattia. Il ruolo infiammatorio di IgG N-glycosylation è stato associato con l’invecchiamento, malattie infiammatorie, malattie autoimmuni, e cancro4.
Con lo sviluppo della tecnologia di rilevamento, i seguenti metodi sono più ampiamente utilizzati nei licoli ad alta produttività: cromatografia ad interazione idrofila (HILIC) cromatografia liquida ad altissima prestazione con rilevamento della fluorescenza (UPLC-FLR), elettroforesi gelpillara multiplalesa con fluorino indotto dal laser rilevamento dell’escenza (xCGE-LIF), spettrometria di massa di desorption/ionizzazione del tempo di ionizzazione del tempo di volo (MALDI-TOF-MS) e spettrometria di massa elettrospray a matrice (LC-ESI-MS) . Questi metodi hanno superato le precedenti carenze di basso flusso, risultati instabili e scarsa specificità di sensibilità5,6.
UPLC è ampiamente usato per esplorare l’associazione tra IgG N-glicosilazione e alcune malattie (ad esempio, invecchiamento7, obesità8, dislipidemia9, tipo II diabete10, ipertensione11, ictus ischemico12, e morbo di Parkinson13). Rispetto agli altri tre metodi di cui sopra, UPLC ha i seguenti vantaggi5,14. In primo luogo, fornisce un metodo di analisi quantitativa relativa e l’analisi dei dati che comporta la normalizzazione totale delle aree migliora la comparabilità di ogni campione. In secondo luogo, il costo delle attrezzature e le competenze richieste sono relativamente bassi, il che rende più facile implementare e trasformare i biomarcatori della glicosilazione in applicazioni cliniche. Presentato qui è un’introduzione a UPLC in modo che possa essere più ampiamente utilizzato.
Protocol
Representative Results
Discussion
UPLC funge da metodo di analisi quantitativa relativa5,15. I risultati indicano che UPLC è una tecnologia di rilevamento stabile con una buona riproducibilità e relativa precisione quantitativa. La quantità di glicani in ogni picco è espressa come percentuale dell’area totale integrata utilizzando UPLC, che è il valore relativo. La quantificazione relativa migliora la comparabilità dei campioni di prova. Inoltre, 96 piastre g di proteine sono utilizzate per…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dalla National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) e dalla australiana-Cina Collaborative Grant (NH & MRC – APP11112767 -NSFC 81561128020).
Materials
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
References
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