Un modelo de expresión de chemocina ectópico para probar el reclutamiento de macrófagos in Vivo
Summary
Para probar el efecto de una quimiocina en el reclutamiento in vivo de macrófagos, se utilizó toda la hibridación in situ del monte para detectar la expresión ectópica de la quimiocina, y se utilizó inmunomanchado para etiquetar los macrófagos. Las imágenes en vivo se utilizaron para la observación en tiempo real de la migración de macrófagos.
Abstract
Los peces cebra son ampliamente utilizados en la investigación básica y biomédica. Muchas líneas transgénicas de pez cebra están actualmente disponibles para etiquetar varios tipos de células. Debido al cuerpo embrionario transparente del pez cebra, es conveniente para nosotros estudiar el efecto de una quimiocina en el comportamiento de un cierto tipo de células in vivo. Aquí proporcionamos un flujo de trabajo para investigar la función de una quimiocina en la migración de macrófagos in vivo. Construimos un plásmido de sobreexpresión específico del tejido para sobreexpresar IL-34 e inyectamos el plásmido en embriones de peces transgénicos de una célula cuyos macrófagos fueron etiquetados específicamente por una proteína fluorescente. A continuación, utilizamos hibridación fluorescente in situ de montaje completo e inmunomancha para detectar el patrón de la expresión de quimiocina y el número o ubicación de los macrófagos. Los embriones WT inyectados fueron levantados para generar una línea transgénica estable. Finalmente, utilizamos imágenes en vivo confocales para observar directamente el comportamiento de los macrófagos en los peces transgénicos estables para estudiar la función de IL-34 en los macrófagos in vivo.
Introduction
Zebrafish es un pequeño pez tropical de agua dulce de huesos duros originario de la India. En cuanto a la conservación del gen, el pez cebra tiene una similitud del 87% con el humano1. Puede proporcionarnos información sobre temas relacionados con el ser humano mediante el estudio de la regulación genética, la función proteica y el comportamiento celular, como la migración, la proliferación et.al en el pez cebra. El embrión zebrafish se puede utilizar para observar el desarrollo de embriones tempranos en diferentes etapas después de inhibir el pigmento. Mientras tanto, el pez cebra tarda sólo tres meses en convertirse en madurez sexual, entonces el pez cebra puede producir cientos de huevos cada 4 días. Mini-tamaño, simple cría, fuerte capacidad reproductiva, estas ventajas hacen que el cultivo de peces cebra muy ahorro de espacio, propicio para el cultivo a gran escala. El ratón modelo de mamífero tradicional tiene costos de mantenimiento más altos que el pez cebra, lo que limita la escala de la elevación del ratón. En el aspecto del desarrollo temprano del embrión, el embrión de ratón es difícil de observar en estado vivo debido a las características del desarrollo del embrión de ratón en el útero materno. Por el contrario, los embriones de pez cebra se desarrollan externamente y son transparentes, por lo que son fáciles de observar bajo un microscopio. Además, el pez cebra es muy fácil de construir una variedad de líneas transgénicas para la investigación de la función génica relacionada. Actualmente, varias líneas transgénicas de pez cebra están disponibles para etiquetar diferentes tipos de células. Es muy conveniente ahora construir líneas transgénicas para sobreexpresar quimiolinas en lugares específicos y estudiar la función de las quimiolinas en el comportamiento celular en el pez cebra.
Aquí, proporcionamos un flujo de trabajo para utilizar la línea transgénica de pez cebra para investigar la función de IL-34 sobre el comportamiento de los macrófagos in vivo2,3,4,5,6,7. En primer lugar, construimos un plásmido de sobreexpresión específico del hígado del gen il34 e inyectamos el plásmido en embriones de peces Tg (mpeg1: GFP) de una célula que etiquetaron específicamente los macrófagos por proteína fluorescente GFP. Luego, utilizamos hibridación fluorescente in situ de montaje completo e inmunomancha para detectar el patrón de la expresión il34 y el número o ubicación de los macrófagos. Los embriones WT inyectados fueron levantados para generar una línea transgénica estable. En estos pasos, establecimos y validamos la línea productora de citoquinas y evaluamos visualmente los efectos que se pueden ver en la distribución de los macrófagos. Por último, para investigar el comportamiento de los macrófagos en respuesta a la citoquina, utilizamos imágenes en vivo confocales para observar directamente la migración de macrófagos para confirmar la función de il34 en la migración de macrófagos in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí nos permite investigar la función de una quimiocina sobre el comportamiento de los macrofagoin vivo y el procedimiento requiere cierta experiencia técnica. En resumen, hay varios pasos críticos para evitar complicaciones en el protocolo: 1) seleccionar una línea transgénica adecuada que muestre una señal transgénica específica y fuerte para etiquetar la célula de interés; 2) seleccionar un tejido apropiado al que se pueda acceder a imágenes y sobreexpresión de genes transgénicos; …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Jingrong Peng por compartir la línea transgénica Tg (fabp10a: DsRed); Dr. Zilong Wen por compartir las líneas transgénicas Tg (mpeg1: GFP); Dr. Koichi Kawakami por proporcionar el vector pTol2. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31771594), los proyectos del Plan de Ciencia y Tecnología de Guangdong (2019A030317001) y los Fondos Fundamentales de Investigación para las Universidades Centrales (D2191450).
Materials
| Antibody | |||
| Alexa 488-Anti-Goat antibody | Invitrogen | A11055 | |
| Anti-Digoxigenin-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
| Goat-Anti-GFP antibody | Abcam | ab6658 | |
| Reagent | |||
| CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
| Cyanine 3 Plus Amplification Reagent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| E2 solution | 15 mM NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 | ||
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Life | 10099-133 | |
| formamide | Diamond | A100314 | |
| glycerol | Sigma | V900860 | |
| heparin sodium | Sigma | H3149 | |
| hybridization buffer(HB) | 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| low melting agarose | Sigma | A9414 | |
| methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
| methylene blue | Sigma | M9140 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| paraformaldehyde(PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask. |
| 10×PBS | 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O | ||
| phenylthiourea(PTU) | Sigma | P7629 | |
| 1×Plus Amplification Diluent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
| 20×Saline sodium citrate(SSC) | 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0 | ||
| sodium citrate | Sigma | A5040 | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| tRNA | Sigma | R6625 | |
| Tween20 | Sigma | P2287 | |
| Plasmid | |||
| pBLK-fabp10a-il34-sv40 | For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation | ||
| pBSK-il34 | For il34 probe preparation | ||
| Fish | |||
| Tg (mpeg1: GFP) | Label macrophages with GFP | ||
| Tg (fabp10a: DsRed) | Label liver cells with DsRed | ||
| Tg (fab10a:il34) | Over-expression IL-34 in liver cells |
References
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