Summary

Хроническая, острая и активированная ВИЧ-инфекция в гуманизированных иммунодефицитных моделях мыши

Published: December 03, 2019
doi:

Summary

Описаны три экспериментальных подхода к изучению динамики ВИЧ-инфекции у гуманизированных мышей. Первый позволяет изучать события хронической инфекции, в то время как два последних позволяет для изучения острых событий после первичной инфекции или вирусной реактивации.

Abstract

Гуманизированный рецептор NOD/SCID/IL-2, который являетсянулевой мыши, резюмирует некоторые особенности иммунитета человека, которые могут быть использованы в фундаментальных и доклинических исследованиях инфекционных заболеваний. Здесь описаны три модели гуманизированных иммунодефицитных мышей для изучения динамики ВИЧ-инфекции. Первая основана на внутрипечетической инъекции CD34и гематопоиетических стволовых клеток у новорожденных мышей, что позволяет восстановить несколько кровяных и лимфоидных тканей, ограниченных клетками, а затем инфекцию с эталонным штаммом ВИЧ. Эта модель позволяет контролировать до 36 недель после инфекции и, следовательно, называется хронической модели. Вторая и третья модели называются острыми и реактивационными моделями, в которых периферийные моноядерные клетки крови интраперитонеально вводятся взрослым мышам. В острой модели клетки здорового донора прививаются через интраперитонеальный путь, за которым следует инфекция с эталонным штаммом ВИЧ. Наконец, в модели реактивации клетки ВИЧ-инфицированного донора в рамках антиретровирусной терапии прививаются по внутриперегитонне. В этом случае безнаркотическая среда в мыши позволяет реактивацию вируса и увеличение вирусной нагрузки. В представленных здесь протоколах описывается обычный экспериментальный подход к гуманизированным, иммунодефицитным моделям мыши ВИЧ-инфекции.

Introduction

Гуманизированный NOD/SCID/interleukin (IL)-2 рецептора Q-цепиnull (в дальнейшем именуемый huNS q-цепнойnull) мышь модель была широко использована для изучения патогенеза инфекций, аутоиммунных и раковых заболеваний, а также для доклинических исследований лекарств и человеческих клеточных терапии1,2. Эти мыши основаны на не-ожирения диабетической (NOD) фон, с научной мутации и целенаправленной мутации на рецепторЕ IL-2-цепь локус (общий q-цепи для IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, и IL-21), которые вызывают серьезные нарушения в развитии мыши T-, B-, и природных киллеров (NK)1. Таким образом, они поддерживают прививок человеческих тканей, человеческих CD34и гематопоитических стволовых клеток (HSCs), и человеческих периферических клеток крови (PBMCs)3,4,5. Кроме того, трансгенное выражение гематопоитических факторов человека, таких как фактор стволовых клеток (СКФ), гранулоцит/макрофаг колонии-стимулирующего фактора (GM-CSF), и IL-3 способствует инпланировке популяций миелоидов человека6,7,8.

Для исследований в области ВИЧ, несколько huNS-цепинулевой мыши модели были описаны, которые отличаются в штамм мыши, тип человеческих клеток, используемых, тип тканей для прививки, и происхождение клеток (т.е., здоровые против. ВИЧ-инфицированный донор)9,10. Оригинальный штамм, однако, широко используется из-за высокого уровня человеческих клеток прививок и вирусной репликации после инфекции с эталонным штаммом ВИЧ11,12,13. Аналогичные иммунодефицитные штаммы мыши с трансгенным выражением гематопоитических факторов человека (например, NOG-EXL или NSG-SGM3) или с имплантатами тканей печени человека и тимуса (костного мозга-печени-тимуса (BLT) мышей) полезны для оценки роли популяций миелоидов в анти-ВИЧ иммунный ответ, воздействие ВИЧ на эти ткани, и их участие в качестве вирусных резервуаров14,15. Кроме того, некоторые штаммы с трансгенным выражением молекул антигена лейкоцитов человека (HLA), а также BLT мышей, могут быть использованы для изучения Т-клеток ответ на ВИЧ-инфекцию16,17.

В целом, у этих мышей гуманизация зависит от клеточного происхождения, маршрута родов (интраперитонеальный, внутрипеченевой, внутривенной, внутривенной, внутрисердечной) и мышиного возраста на момент прививки18,19,20. Что касается происхождения клеток, человека CD34и HSC, полученных из пуповинной крови, печени плода, или мобилизованной периферической крови могут быть введены в новорожденных или молодых мышей3,21. Кроме того, взрослыенулевые мыши могут быть гуманизированы путем инъекции PBMC (здесь, именуемые hu-PBL-NS q-цепнойнулевой мышей), что позволяет височной циркуляции этих клеток в крови, вторичных лимфоидных органов, и воспаленные ткани22,23,24.

Описан освоенным здесь подробный протокол для создания huNS-цепинулевая мышь модели для изучения ВИЧ-инфекции. Во-первых, это хроническая модель, в которой человека CD34и HSCs, полученных из пуповинной крови от здорового донора вводятся у новорожденных мышей, а затем инфекции с эталонным штаммом ВИЧ после 14 недель восстановления иммунной системы человека. Эта модель позволяет контролировать мышей в течение 36 недель после заражения. Вторая модель представляет собой острую модель, в которой ПБМК, полученных от здорового донора, вводятся у взрослыхнюловых мышей NS и цепи, за которой следует инфекция с эталонным штаммом ВИЧ после 3 недель расширения Т-клеток человека в мыши. Наконец, третьей моделью является модель реактивации, в которой ПБМК, полученные от ВИЧ-инфицированного донора в рамках подавлятельной антиретровирусной терапии (АРТ), вводятся взрослым н.п. цепинулевых мышей. В этом случае безнаркотическая среда позволяет реактивацию вирусной терапии и увеличению вирусной нагрузки. Две последние модели позволяют осуществлять мониторинг в течение 9 недель после прививки.

В целом, эти три модели полезны для вирусологических исследований, доклинических исследований новых препаратов и оценки воздействия ВИЧ-инфекции на глобальный иммунный ответ. Важно также учитывать, что использование ВИЧ-инфицированных гуманизированных мышей требует рассмотрения и одобрения Со стороны Институционального комитета по биобезопасности (IBC), а также Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) перед любым экспериментом. Это гарантирует, что исследование следует всем внутренним и внешним институциональным нормам использования опасного биологического материала и гуманной обработки экспериментальных животных.

Protocol

В этой работе все процедуры по уходу за животными и процедуры выполнялись в соответствии с протоколами, рассмотренными и утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) в Медицинской школе Университета Мэриленда (протокольные номера 1018017, 1018018 и 0318…

Representative Results

Как описано выше, в 14 недель после HSC инъекции (хроническая модель) или на 3 недели после PBMC инъекции (острые и реактивации моделей), мышей кровоточат для скрининга уровня человеческих клеток прививок потокцитометрии. Репрезентативная стратегия gating для оценки 1) человека CD45- реконст…

Discussion

Важные достижения были достигнуты в развитии иммунодефицитных штаммов мыши для гуманизации, с рядом различных вариантов, которые могут быть использованы в соответствии с интересом исследования1. Здесь приведен общий протокол для гуманизации н.с. цепинулевых мышей и…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана IHV клинического отдела внутренних средств в JC.

Materials

0. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3735.S.X
1. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3745.S.X
10 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0010
15 ml conical tubes Stellar scientific T15-600
25 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0025
5 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0005
50 ml conical tubes Stellar scientific T50-600
ACK lysis buffer Quality biological 118-156-101
Alcohol prep pads Fisher scientific 06-669-62 Sterile
Anti-Human CD3 clone UCHT1 Biolegend 300439 APC conjugated
Anti-Human CD4 clone OKT4 Biolegend 317420 AF488 conjugated
Anti-Human CD45 clone 2D1 Biolegend 368522 BV421 conjugated
Anti-Human CD8 clone SK1 Biolegend 344710 PerCP-Cy5.5 conjugated
Biosafaty cabinet level 2 If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane
Bonnet Fisher scientific 17-100-900 Single use cap for basic protection
Cavicide Metrex 13-1000 Surface desinfectant
CD34+ cells Lonza 2C-101 As many vials available from a single donor
Centrifuge Beckman 65-6KR
Clear jar Amazon 77977
Cotton gauze pad Fisher scientific 22-415-468 Sterile
Disposable lab coats Fisher scientific 19-472-422
EDTA micro tubes Greiner bio-one 450480
Face Mask Fisher scientific 17-100-897
FACS lysing solution BD 340202
FBS premium HI Atlanta biologicals S1115OH
Ficoll GE health one 17-1440-02
Flow cytometer We used FACS Aria II
Flow cytometry tubes Falcon 352054 5 ml polystyrene and round bottom
HIV BaL Prepared in our uQUANT core facility
Human PBMCs HIV positive and negative volunteers
Infrared warming pad Venet scientific DCT-25 Temporary therapeutic warming pad for small animals
Isentress (Raltegravir) Merck NSC 0006-0227061 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Mark I irradiator Equipment belonging to university of Maryland
Micro pipettes
Microcentrifuge Eppendorf
Mouse ear tags National Band & Tag company 1005-1L1
Natelson blood collection tubes Fisher scientific 02-668-10
NOG-EXL Taconic HSCFTL-13395-F
NSG mice Jackson 5557 Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment
NSG-SGM3 Jackson 13062
Paraformaldehyde 16% Electron microscopy sciences 15710
PBS 1X pH 7.4 Gibco 100-10-023
Petri dishes Fisher scientific 08-757-28
Quantistudio qPCR machine Thermo QS3
Reagent reservoirs Costar 4870
RPMI media 1640 1X Gibco 11875-093
Shoe covers Fisher scientific 17-100-911
Sterile disposable Gloves Microflex SUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix Invitrogen 10080-400 cDNA synthesis
Syringes 28-G x 1/2 BD 329-461
Syringes 29-G x 1/2 BD 324-702
Truvada (Emtricitabine and Tenofovir Gilead NDC 61958-0701-1 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor
Trypan blue Sigma T8154 Cell count and viability
Vick Vaporub School health 43214 Ointment based on menthol and eucalyptus
Water molecular biology grade Quality biological 351-029-131

References

  1. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
  2. Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
  3. Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  4. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  5. Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
  6. Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
  7. Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
  8. Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
  9. Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
  10. Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
  11. Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  12. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118 (2018).
  13. Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
  14. Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
  15. Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), 1-16 (2019).
  16. Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID “Meet the Experts” 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
  17. Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, 150-154 (2013).
  18. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
  19. Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of “humanized” mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , (2008).
  20. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, 67-78 (2016).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  22. King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
  23. King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
  24. Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
  25. Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
  26. Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  27. Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
  28. Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), 1004-1014 (1994).
  29. Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , 15-24 (2015).
  30. Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
  31. Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280 (2012).
  32. Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
  33. Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
  34. Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, 155-159 (2013).
  35. Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
  36. Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
  37. Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
  38. Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
  39. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  40. Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233 (2015).

Play Video

Cite This Article
Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Heredia, A., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models. J. Vis. Exp. (154), e60315, doi:10.3791/60315 (2019).

View Video