患者来源的胰腺导管腺癌类器官模型的分离与表征

摘要

胰腺导管腺癌的患者来源类器官培养是一种快速建立的三维模型，能够高保真地代表上皮肿瘤细胞区室，为这种致命恶性肿瘤的转化研究提供了有力工具。本文中，我们提供了建立和扩增类器官以及利用这些模型进行相关生物学检测的详细方法。

摘要

胰腺导管腺癌（PDAC）是最具致死性的恶性肿瘤之一。近年来，已有研究报道了可实现该疾病三维（3D）建模的下一代类器官培养方法。患者来源的类器官（PDO）模型可从手术标本以及小体积活检组织中分离获得，并能在体外快速形成。重要的是，类器官模型能够保留患者肿瘤中检测到的致病性遗传改变，并可预测患者对治疗的反应，从而支持转化医学研究。本文提供了将组织培养工作流程优化以用于研究三维基质包埋类器官模型的完整实验方案。我们详细阐述了原代PDAC类器官的分离与传代培养的方法及相关注意事项。此外，我们还介绍了如何在实验室中配制和进行定制类器官培养基的质量控制。最后，我们描述了对类器官模型进行下游表征的检测方法，包括核酸（DNA和RNA）的提取以及药物敏感性测试。尤为重要的是，我们提供了在科研实验室中实施类器官技术所需的关键注意事项。

引言

胰腺导管腺癌（PDAC）是一种致命性疾病，其特征是大多数患者确诊时已处于晚期，缺乏有效的治疗方法，导致5年总生存率始终低于10%¹。仅有20%的患者在确诊时疾病尚处于局限阶段，适合进行根治性手术干预^2,3。其余患者通常接受多种化疗药物联合治疗，但这些疗法仅对少数患者有效^4,5。为应对这些迫切的临床需求，研究人员正在积极开发早期检测策略并研制更有效的治疗方法。为了加快重要发现的临床转化，科学家们正在采用基因工程小鼠模型、患者来源的异种移植模型、单层细胞系，以及最近兴起的类器官模型⁶。

利用富含生长因子和Wnt配体的条件培养三维上皮类器官，以促进未转化前体细胞增殖的方法，最初在小鼠肠道中被报道⁷，并迅速被应用于正常人胰腺组织⁸。除正常导管组织外，类器官技术还可用于人胰腺导管腺癌（PDAC）的分离、扩增和研究⁸。重要的是，该方法支持从手术标本以及细针和粗针穿刺活检样本中建立类器官，使研究人员能够研究疾病的所有阶段<....

方案

所有用于研究的人体组织采集均经本机构审查委员会（IRB）审核并批准。以下所有实验步骤均在哺乳动物细胞培养实验室环境中，于无菌条件下进行。

1. 培养基制备

1. 条件培养基的制备。
   注意：人胰腺类器官培养基需要丰富的生长因子和营养物质，并需添加条件培养基以提供足够的生长刺激，促进类器官扩增。以下所述的两种条件培养基均来自 commercially available 细胞系（参见材料表）。有关完整的实验方案和材料信息，请参考生产商的官方网站。
   1. 根据生产商的实验方案制备 R-spondin1 条件培养基。
      1. 首先，在含有丰富血清（10%）的条件下，使用适当的抗生素（Zeocin）筛选方法扩增表达 R-spondin1 的 293T 细胞。在制备条件培养基时，需撤除并彻底清洗掉抗生素和血清，确保最终的条件培养基中不含任何抗生素和血清。重要的是，收集后的条件培养基必须经过滤除菌（0.2 µm），以防止交叉污染。
      2. 分装后的条件培养基可短期保存于 4 °C（6 个月内使用）或长期保存于 -20 °C（超过 6 个月）。应避免反复冻融。
   2. 根据生产商的实验方案制备 L-Wnt-3A 条件培养基。
      1. 首先，在含有丰富血清（10%）的条件下，使用适当的抗生素（G-418）筛选方....

结果

为了说明从胰腺导管腺癌（PDAC）中分离类器官所面临的挑战，我们展示了如何从小份细胞含量较低的肿瘤样本中建立患者来源的类器官培养物。在初次接种后，每个孔中仅可见少量类器官，如图1所示。类器官被允许生长两周时间，并根据我们的方案进行传代，以建立更为稳定的培养体系，早期和晚期第1代的代表性图像如图1所示。需要注意的是，在初次分离的晚期阶段观察到的较大囊状类器官，在将类器官与冰上预冷的基底膜提取物（BME）混合时（见步骤2.13），极易破碎成较小的片段。

为了展示药物表型分析方案的结果，我们按照本方案所述方法，从一个已建立且生长迅速的代表性胰腺导管腺癌（PDAC）类器官中制备了单细胞悬液。每孔接种1000个活细胞，培养24小时使其恢复，随后加入细胞毒性化疗药物吉西他滨（Gemcitabine）和紫杉醇（Paclitaxel）进行处理。我们进行了三复孔的9点剂量反应实验，起始剂量为100 pM，最高剂量为2 µM。经过5天的药物处理后，分别拍摄了对照溶剂（DMSO）、2 .......

讨论

本文介绍了分离、扩增和表征患者来源的胰腺导管腺癌（PDAC）类器官的现有方案。目前建立类器官培养的成功率超过70%；因此，这些方法尚未完全成熟，预计将随时间不断改进和完善。在取样时应充分考虑样本大小，因为PDAC的肿瘤细胞含量较低。因此，小样本中所含肿瘤细胞数量较少，仅能生成少量类器官。此外，许多患者在手术干预前会接受基于化疗和/或放化疗的新辅助治疗¹⁵。如果某种治疗对特定患者有效，则其肿瘤组织中可能不含存活细胞。为初步优化这些方法，优先获取未经化疗的患者样本较为理想，但实际情况中并不总能实现。有趣的是，我们发现肿瘤组织手术切除后的缺血时间并非类器官成功分离的主要决定因素，只要样本在24小时内完成处理即可。

胰腺导管腺癌是一种以显著的促结缔组织增生反应和致密间质基质沉积为特征的疾病。类器官虽然是快速分离和扩增上皮成分的优良工具，但该模型无法重现胰腺导管腺癌（PDAC）复杂的间质结构。其他方法，如患者来源的异种移植模型¹⁶或气液界面培养¹⁷，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12通道移液器（p20、p100或p200）及吸头
12孔板	Olympus	25-106
15 ml LoBind锥形管	Eppendorf	EP0030122208
15 ml管旋转混合仪和/或振荡混合仪
37 °C CO2 培养箱
37 °C 水浴锅
384孔板	Corning	4588	超低吸附、黑色、光学透明
A 83-01	TOCRIS	2939
ADV DMEM	ThermoFisher	12634010
无动物源性重组人EGF	Peprotech	AF-100-15
自动细胞计数仪
B27添加剂	ThermoFisher	17504044
Cell Recovery Solution	Corning	354253	在4 °C下使基底膜提取物解聚的试剂
CellTiterGlow	Promega	G7570	发光法细胞活力检测试剂
氯仿	Sigma	C2432
计算机
CryoStor CS10	StemCELL Tech	07930	细胞冻存液
Cultrex R-spondin1 (Rspo1) 细胞	Trevigen	3710-001-K
DMEM	ATCC	30-2002
DNase I	Sigma	D5025
药物打印仪	Tecan	D300e	本实验室使用的药物打印仪
Excel			用于数据分析
超细Graefe镊	Fine Science Tools	11150-10
FBS	ThermoFisher	16000044
G-418	ThermoFisher	10131035
胃泌素I（人源）	TOCRIS	3006
温和型胶原酶/透明质酸酶	STEMCELL Tech	7919
GlutaMAX	ThermoFisher	35050061	谷氨酰胺溶液
GraphPad Prism			用于数据分析
HEPES	ThermoFisher	15140122
层流式组织培养罩
发光检测仪
表达L-Wnt-3A的细胞	ATCC	CRL-2647
MACS组织保存液	Miltenyi biotec	130-100-008
Matrigel基质	Corning	356230	基底膜提取物（BME），生长因子减少型
Mr. Frosty冻存容器	ThermoFisher	5100-0001
N-乙酰半胱氨酸	Sigma	A9165
烟酰胺	Sigma	N0636
p1000移液器及吸头
p200移液器及吸头
PBS	ThermoFisher	10010049
青霉素/链霉素	ThermoFisher	15630080
primocin	InvivoGen	ant-pm-2
快速过滤单元（0.2 µm）	ThermoFisher	121-0020
重组人FGF-10	Peprotech	100-26
重组小鼠Noggin	Peprotech	250-38
无菌一次性手术刀，#10刀片	VWR	89176-380
组织培养离心机
组织培养皿，10 cm	Olympus	25-202
TRIZol	ThermoFisher	15596018	酸性苯酚溶液
TrypLE Express	ThermoFisher	12605010
Y-27632	Sigma	Y0503
Zeocin	ThermoFisher	R25001