在本实验方案中，我们介绍如何简便地处理和培养接受部分手术切除扁桃体的健康人来源的扁桃体单个核细胞，以研究其在激活后模拟黏膜组织中病毒感染时的固有免疫应答。
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方法文章
分离扁桃体单个核细胞以研究人体黏膜淋巴组织中外植体的先天免疫应答
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
研究来自黏膜相关淋巴组织（MALT）的分离细胞有助于理解涉及黏膜免疫的病理过程中免疫细胞的反应，因为这些细胞可在组织中模拟宿主与病原体的相互作用。尽管来源于组织的分离细胞是最早的细胞培养模型，但由于组织获取困难，其应用一直被忽视。在本实验方案中，我们介绍如何简便地处理并培养健康人扁桃体来源的扁桃体单个核细胞（TMCs），以研究在模拟黏膜组织病毒感染条件下激活的固有免疫应答。从扁桃体中分离TMCs操作快速，因为扁桃体几乎不含上皮组织，且可获得多达数十亿个主要免疫细胞类型。该方法可利用多种技术检测细胞因子的产生，包括免疫检测、qPCR、显微镜观察、流式细胞术等，其应用方式类似于使用外周血单个核细胞（PBMCs）。此外，TMCs在药物测试中表现出比PBMCs更高的敏感性，在未来的毒性检测中需予以考虑。因此，TMCs的离体培养是一种简便且易于获取的黏膜模型。
引言
由于可及性以及明显的伦理原因，对人体器官的研究受到限制。然而，这些研究对于全面理解人类生物学的复杂性至关重要。分离细胞（原代培养或细胞系）的培养体系因其易获得性，已成为细胞生物学研究中的标准系统。尽管分离细胞培养已促成许多重要发现，但细胞系的应用正受到更为严格的审视，因为它们无法完全模拟体内器官的生物学特性。然而，三维细胞或组织外植体的培养又极为复杂4,5,6。事实上，组织或器官片段具有高度异质性，其细胞组成因在组织中的位置不同而存在差异。因此，使用组织块需要进行大量技术重复和生物学重复分析，从而需要大量供体或患者样本。
黏膜相关淋巴组织（MALT）在结构上类似于淋巴结，但具有独特的功能，因为其主要作用是调节黏膜免疫7。与通常位于组织较远部位的淋巴结不同，MALT通常位于黏膜组织上皮的正下方。组织学上，它们主要由高浓度的B细胞和T细胞组成，同时也包含巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞。MALT约占人体淋巴组织总量的50%。根据其解剖位置，MALT可分为九个亚群：GALT（肠道）、BALT（支气管）、NALT（鼻腔）、CALT（结膜）、LALT（喉部）、SALT（皮肤）、VALT（外阴）、O-MALT（有序结构型）和D-MALT（弥散型）。其中O....
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方案
标本并非专门为研究目的而采集，且该研究不被视为侵入性研究。然而，人类扁桃体的采集需要获得当地相关机构的伦理批准。在本研究中，已获得人员保护委员会（Comité de Protection des Personnes，IDRCB/EUDRACT：2018A0135847）的批准。此外，还需获得每位患者或其法定代理人同意，以获取有助于解释实验结果的捐赠者个人资料（如性别、年龄、耳鼻喉感染史）。
1. 人扁桃体组织的处理
- 根据相关机构的建议，将每位供体的扁桃体放入一个无菌的50 mL试管中，试管内含25 mL 1× PBS，并在室温（RT）下运输至实验室（采用三层防护：试管、安全盒和袋子）。
注意：整个操作应在生物安全二级实验室中进行。所有人体样本均应谨慎处理，因其未经预先筛查，可能含有传染性病原体。 - 每次使用后均需清洁所有工具。
- 使用后拆卸细胞筛，与其他器械（如研杵、镊子）一起置于含有洗涤剂溶液（1/10体积的洗涤剂溶于H2O中）的容器内，过夜浸泡。
- 用刷子刷洗每件器具以去除残留组织，并用清水冲洗干净。
- 将所有部件充分干燥后，准备细胞筛（85 mL，37 mm直径），方法是将60目不锈钢网置于10目不锈钢网之上，并拧紧固定环。
- 将所有工具放入无菌....
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结果
我们首先表征了培养物中存在细胞的免疫谱型，并分析了扁桃体单个核细胞（TMCs）的数量。我们采用流式细胞术对来自扁桃体的TMCs进行了表型分析。如图1所示，来自血液的外周血单个核细胞（PBMCs）中存在的所有主要免疫细胞类型在来自扁桃体的TMCs中均有存在。然而，在TMCs中，除B细胞外，所有细胞类型的频率均低于PBMCs中的频率。
图1：扁桃体中TMCs的表型分析。 来自健康供体的TMCs通过人扁桃体组织解剖及细胞分离获得。（
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讨论
人类扁桃体代表了一种整合性且生理性的离体模型，可用于研究黏膜界面的固有免疫应答，因为其模拟了次级淋巴器官的功能。有趣的是，TMCs 的细胞组成与 PBMCs 相似，包含所有主要的细胞群体，尽管其细胞比例可能与外周血来源的 PBMCs 不同（图1）。此外，还可发现其他细胞群体，因为所有免疫应答均起始于组织（黏膜或次级淋巴器官）而非血液中。
使用人组织外植体、细胞培养或血细胞各有其优势。然而，在研究细胞因子分泌和细胞活化方面，组织外植体并非最佳模型。事实上，我们在组织外植体的上清液中未能检测到任何干扰素（IFN）的产生（图2B）。我们推测这些细胞因子可能被周围细胞直接消耗。另一方面，外周血单个核细胞（PBMCs）的刺激可模拟机体对感染的初始免疫应答，但无法反映组织内发生的免疫过程——而大多数细胞因子的产生以及病毒的复制均发生在组织中。因此，我们建立了一种从次级淋巴组织——扁桃体中分离和纯化细胞的实验方案。我们从健康人扁桃体中纯化了扁桃.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了法国艾滋病与肝炎研究署（ANRS）（J-P.H）对实验以及N.B.奖学金（AAP 2017 166）的资助。N.S.感谢ANRS对其奖学金（AAP 2016 1）的支持、欧洲分子生物学组织（EMBO）提供的奖学金（LT 834 2017）、乌尔姆大学医学院启动资金项目"Baustein"（LSBN.0147）以及德国研究基金会（DFG）（SM 544/1 1）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10目钢网 - 1910 µm | Dutscher | 198586 | 用于放入Cellector细胞滤器 |
| 60目钢网 - 230 µm | Dutscher | 198591 | 用于放入Cellector细胞滤器 |
| 70 µm 白色ClearLine细胞滤器 | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D 清洗剂 | Dutscher | 59852 | 清洗剂 |
| 抗生素溶液，100倍浓缩液 | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素——用于添加至培养基中 |
| BD FalconTM 圆底离心管，5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS 管 |
| Cellector细胞滤器，85 mL，直径37 mm | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) 发光法细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7572 | 细胞活力检测 |
| Centrifuge 5810 R 离心机 | Eppendorf | ||
| Falcon 50 mL 锥形离心管 | Dutscher | 352070 | |
| 弯头镊子 | Dutscher | 711200 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | D8537 | 不含钙和镁 |
| EnVision | PerkinElmer | 用于检测发光信号 | |
| 胎牛血清（FBS） | 用于添加至培养基中 | ||
| 荧光标记抗体 | 见表1 | ||
| 玻璃研磨棒 | Dutscher | 198599 | |
| Hepes（1 M） | Thermo Fisher | 15630056 | 使用浓度为20 mM |
| 培养箱 | |||
| LEGENDplex 人抗病毒反应检测试剂盒 | BioLegend | 740390 | 基于微球的免疫检测试剂盒 |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | 密度梯度分离液 |
| Mr. Frosty 冷冻容器 | Thermo Fisher | 5100-0001 | 慢速冷冻容器 |
| Pierce 16% 甲醛（w/v），无甲醇 | Thermo Fisher | 28908 | |
| 瑞喹莫德（R848） | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 激动剂 |
| RPMI-1640 培养基 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL 细胞培养皿，150 mm × 25 mm（SPL150） | Dutscher | 330009 | |
| 无菌外科刀片 N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads 补偿微球 | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | 用于配制PBS洗涤缓冲液 |
参考文献
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O.
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重印与许可
