إجراء خزعات قرصة مُرشدة بالمنظار في الفئران وتقييم التغيرات اللاحقة في الأنسجة
Summary
هنا، نقدم وصفا مفصلا للإجراءات التي تحث خزعات قرصة متناظرة موجهة في الفئران وتتبع إغلاق الجروح في الوقت الحقيقي. وبالإضافة إلى ذلك، يتم توفير طرق لإعداد الأنسجة للتحليلات النسيجية والمناعة الكيميائية والجزيئية لسرّد الجرح.
Abstract
فهم الأنسجة والتغيرات الخلوية التي تحدث في الاستجابة للاصابة الحادة وكذلك خلال عملية التئام الجروح هو من الأهمية بمكان عند دراسة أمراض الجهاز الهضمي (GI). نموذج خزعة قرصة القولونية مورين هو أداة مفيدة لتحديد هذه العمليات. بالإضافة إلى ذلك، يمكن دراسة التفاعل بين محتوى الأمعاء (على سبيل المثال، الميكروبات) والقولون. ومع ذلك، يمكن أن يكون تحريض الجروح والقدرة على تتبع إغلاق الجروح مع مرور الوقت بطريقة موثوقة تحديا. وعلاوة على ذلك، يجب أن يتم إعداد الأنسجة والتوجه بها بطريقة موحدة لاستجواب الأمثل التغيرات الهستوولوجي والجزيئية. هنا، نقدم طريقة مفصلة تصف الإصابة الناجمة عن الخزعة ورصد إغلاق الجروح من خلال تكرار تنظير القولون. ويرد وصف النهج الذي يضمن قياسات متسقة وقابلة للتكرار من حجم الجرح، والقدرة على جمع السرير الجرح للتحليلات الجزيئية وكذلك تصور سرير الجرح عند تقسيم الأنسجة. القدرة على تنفيذ هذه التقنيات بنجاح يسمح لدراسات الاستجابة للإصابة الحادة، والتئام الجروح والتفاعلات المستضيفة داخل القولون.
Introduction
الجهاز الهضمي (GI) هو نظام الجهاز المعقد نظرا لوظائفه المتعددة، وأنواع الخلايا المضيفة (مثل الظهارية، المناعي، stromal، الخ) فضلا عن تريليونات من الميكروبات. في ضوء هذا التعقيد، وأمراض الجهاز الهضمي غالبا ما تنطوي على التفاعل بين كل هذه العوامل. على سبيل المثال ، ترتبط أمراض الأمعاء الالتهابية (IBD) بدورات الالتهاب والمغفرة في الجهاز الهضمي ، والتي تنطوي على تنشيط الخلايا الالتهابية ، dysbiosis ، والإصلاح الظهاري1،2،3،4،5،6،7. وجود نظم نموذج مناسب لدراسة مرض التهاب الأمعاء والظروف الالتهابية الأخرى في الجهاز الهضمي أمر بالغ الأهمية لتوضيح التسبب في المرض. توجد عدة نماذج لدراسة التسبب في مرض الالتهابات المتعددة الوبائيات بما في ذلك الفئران المعدلة وراثيا واستخدام المواد الكيميائية مثل كبريتات الصوديوم dextran (DSS) في القوارض8،9،10. وتشمل القيود المفروضة على هذه النماذج عدم القدرة على التحكم بدقة في تحريض الالتهاب، فضلا عن الصعوبات في تقييم التئام الجروح. يمكن أن تكون الطرق البديلة لمحاكاة جوانب من مرض الالتهابات الالتهابية IBD مفيدة لتطوير العلاجات.
توفر خزعات قرصة المنظار الموجهة في الفئران نظامًا نموذجيًا مفيدًا لدراسة التسبب في الاستجابة الالتهابية ، والتئام الجروح ، بالإضافة إلى تفاعلات الميكروب المضيف في القولون. وقد استخدم هذا النهج لأول مرة كأداة تجريبية في عام 2009، والتي أظهرت فائدتها لدراسة الاستجابة الالتهابية الحادة والتئام الجروح في القناة الهضمية11. واستخدمت الدراسات اللاحقة هذه التقنية لتقييم أدوار مسارات الإشارات المختلفة وكذلك ميكروبيوتا الأمعاء ، في التئام الجروح القولونية11،12،13،14،15،16،17،18. في الآونة الأخيرة، استخدمت مجموعتنا هذا النموذج للتحقيق في أهمية sphingosine-1-الفوسفات الإشارات والبكتيريا في الاستجابة الحادة لإصابة القولون19. على الرغم من أنه مفيد ، يمكن أن يكون إجراء خزعات قرصة موجهة بالمنظار في الفئران وتقييم تغييرات الأنسجة اللاحقة أمرًا صعبًا تقنيًا. على سبيل المثال، يمكن أن يحدث ثقب الأمعاء عند تحريض الإصابة وضمان قياسات متسقة من السرير الجرح من خلال تنظير القولون التسلسلي يمكن أن يكون من الصعب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن توجيه الأنسجة القولونية بشكل صحيح لتصور سرير الجرح للتحليلات النسيجية أو المناعية الكيميائية يكون تحديا. على الرغم من وجود بعض المعلومات بشأن هذه الأساليب18,20, وصف دقيق خطوة الحكيمة من هذه التقنيات على طول سوف البصرية المساعدات وعود لتعزيز الموثوقية وفائدة أوسع لهذا النموذج. هنا ، نقدم طريقة مفصلة لتنفيذ خزعات قرصة متناظرة موجهة في الفئران ، وتتبع إغلاق الجروح بمرور الوقت وإعداد الأنسجة لتمكين التحليلات الهستويولوجية والجزيئية للسرير الجرحي. يمكن إنشاء طريقة قياسية لتنفيذ هذه التقنيات توسيع استخدام هذا النموذج لدراسة الوسطاء الذين لم يتم التحقيق في السابق التي يحتمل أن تكون مهمة لالتهاب GI وإصلاح الجرح.
Protocol
Representative Results
Discussion
ضمان خزعات متسقة ودقيقة وكذلك قياسات حجم الجرح هي ذات أهمية قصوى عند محاولة تقييم فعال لمعدل إغلاق الجرح في هذا النموذج. ولذلك، ينبغي اتخاذ عدة تدابير للتأكد من أن الإجراءات يجري تنفيذها على النحو الصحيح. أولاً، يجب ألا يكون عمق الخزعة ضحلاً أو عميقاً جداً. إذا كانت ضحلة جدا، لن يكون هناك ن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من مؤسسة كرون والتهاب القولون (D.C.M) ومؤسسة نيويورك كرون (D.C.M و A.J.D.). يشكر المؤلفون السيدة كارمن فيرارا على مساعدتها في إنشاء مرافقة الفيديو لهذه المقالة.
Materials
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
References
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
