Method Article

西普库鲁斯核素体液的原位杂交

DOI:

10.3791/61022

⸱

May 1st, 2020

 ,  , 
1Key Laboratory of Xiamen Marine and Gene Drugs, School of Biomedical Sciences, Huaqiao University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议描述了一种有效的原位杂交方法，用于检测西普库鲁斯核糖体流体中目标基因的mRNA表达水平和空间模式。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

原位杂交 （ISH） 是一种非常翔实的技术，用于在组织中呈现特定基因（例如 mRNA 和 ncRNA）的细胞分布模式。虹吸虫西潘库鲁斯核苷，是一种重要的渔业资源，因为它具有较高的营养和药用价值。目前，西潘库鲁斯核子分子生物学的研究还处于起步阶段。本文的目的是开发一种敏感的方法，用于在虹吸虫核糖体流体中局部特定的mRNA。该协议包括ISH的详细步骤，包括二戈西根宁标记的抗感觉和感觉核探针制备、共母液收集和截面制备、特定的核试探杂交、抗体孵育、着色和着色后处理。演示了使用该方法的成功实验取得的代表性结果。该协议也应适用于其他西潘库拉物种。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ISH，使用标记的核酸探针来检测特定的DNA或RNA感兴趣的序列，是描述形态保存组织11、2、32,3中目标基因的空间表达模式的有用方法。通常，目标序列由聚合酶链反应（PCR）生成，然后用作模板，合成标有二戈西根尿碱-5'-三磷酸的抗感觉/感觉RNA探针。样品在用核试探孵育前固定并渗透。洗掉多余的探针后，利用抗地氧辛抗体，即碱性磷酸酶33、4、5、6，4,5,6通过免疫组织化学进行可视化。

西潘库鲁斯努杜斯（菲勒姆·西潘库拉;命令西潘库利达:西潘库利达）是一种未分割、共和和双边对称的海虫77、8。8虹食核生物是一种国际性物种，广泛分布于热带和温带沿海水域。也是中国南方重要的海洋渔业资源，因其高营养和药用价值9,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

动物程序经华桥大学动物福利委员会批准。

1. 核试探准备

  1. 底漆设计
    1. 打开程序引页 3 （http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/）。将dmrt1序列（GenBank: MK182259）复制到序列窗口中。
    2. 设置底漆长度（23-25 bp）、熔融温度（55-60°C）和G/C含量（40-60%）。单击"选取底漆"。
      注:RNA探针所需的最小尺寸约为500bp。较长的探针通常具有较高的特异性。
    3. 将T7RNA聚合酶促进剂序列（5，-TAATACGACTATAGGG-3）添加到选定的,引物之一。 ISH 的dmrt1底漆序列显示在表 1中。
      注:对于检测器，T7 RNA聚合酶促进剂位于正向引物的5'末端。对于抗感觉探针，T7 RNA聚合酶促进剂位于反向引物的5'端。
  2. PCR 放大
    1. 将微熔管放在冰上，并准备以下反应混合物（用于 50 μL 反应）:1x Taq DNA 聚合酶混合物、1 μg cDNA（从 100 μL 的共乳液制备）、1 μM 正向底漆、1 μM 反向底漆和无核酸酶水。
    2. 通过移液和离心机将PCR反应简单混....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

图 1中说明了 ISH 中涉及的步骤的摘要。从从共性流体cDNA放大的PCR产物中合成了dmrt1的抗感觉和相应的感觉核探针。通过直接测序验证了PCR产品的真实性。根据制造商的协议和以前的报告4，使用T7RNA聚合器合成了Riboprobes，并进行了一些小的修改。ISH 的代表性信号如图2所示。以dmrt1为目标的西潘库鲁斯核糖体流体的ISH显示紫染色集中在精子的营养细胞中（图2A、B、红色箭头）。感觉核探针用作负控制，dmrt1的测感测义探针未检测到任何杂交信号（图2C）。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

先前的研究表明，ISH适用于探测多个目标RNA16、17、18。,17,18在此协议中，我们描述了一种高分辨率ISH方法，用于检测共分液中的mRNA，并强调西潘库鲁斯核糖的优化杂交条件。我们观察到的dmrt1的明显信号证明了该协议在基因表达检测中的成功应用（图2）。

在实验中，需要特别注意一系列步骤。首先，目标基因的感官核探针必须作为对照进行合成。合成后，应在凝胶上检查核试探的质量。RNA合成不良将导致部分无染色。其次，样品采集过程应温和，以防止细胞变形，实验必须在共性液体采集后立即进行，以防止RNA降解。第三，在没有任何缩短或延长的情况下，应在所有步骤中准确遵循孵化时间和时间。特别要注意蛋白酶K治疗的时机。蛋白酶K的处理时间过长会导致样品细胞结构的破坏，而治疗时间太短，使核糖皮不能正常进入细胞。最后，.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了中国国家自然科学基金（第31801034号）、中国福建省自然科学基金（2016J01161）、华桥大学科研基金（15BS306）和华桥大学科研研究生创新基金的支持。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
琼脂糖Biowest111860
抗地高辛-AP Fab 片段罗氏11093274910
BCIP/NBT 碱性磷酸酶显色试剂盒BeyotimeC3206
牛血清白蛋白SigmaB2064
离心机Eppendorf5415R
柠檬酸国药化学试剂有限公司5949-29-1
国药化学试剂有限公司酸三钠6132
盖玻片BeyotimeFCGF60
去离子甲酰胺Amresco1975
焦碳酸二乙酯，DEPCSigmaD5758有害物质
地高辛 （DIG） RNA 标记混合物罗氏11277073910
DNase I，不含 RNase的 Invitrogen18047019
EDTASigma431788
电泳凝胶成像Bio-RadUniversal Hood III
乙醇药化学试剂有限公司64-17-5
凝胶提取试剂盒OmegaD2500
凝胶电泳仪北京柳一仪器厂DYY-6C
甘油国药化学试剂有限公司56-81-5
甘氨酸SigmaG5417
肝素Sigma8/1/9041
KCl国药化学试剂有限公司7447-40-7
KH2PO4国药化学试剂有限公司7778-77-0
氯化锂西格玛203637
马来酸国药集团化学试剂有限公司110-16-7
国国药集团 化学试剂有限公司67-56-1有害物质
MgCl2国药化学试剂有限公司7786-30-3
Na2HPO4国药化学试剂有限公司7558-79-4
NaCl生物源JT0001
NaOH国药化学试剂有限公司1310-73-2腐蚀性
石蜡膜Bemis Company， Inc.PM-996
多聚甲醛、PFASigma158127 有害物质
PCR 仪器Life TechnologyProflex
PinsDeli16
移液器Eppendorf加 G
聚-D-赖氨酸处理的显微镜载玻片LiushengVER_A01
KSigma
不含 RNase 的水HyCloneSH30538. 02
RNase 抑制剂Roche3335399001
S. nudus
绵羊血清BeyotimeC0265
载玻片染色罐BeyotimeFG010
载玻片储存盒BeyotimeFBX011
小高压灭菌剪刀双路sku_8330
分光光度计Thermo FisherNanoDrop 2000/2000c
T7 RNA 聚合酶罗氏10881767001
Taq DNA 聚合酶混合物 （2X）Thermo ScientificK1081
Tris HClSigmaRES3098T
tRNA罗氏
Tween-20SigmaP1379
水浴郑州长城科技工业HH-S2
柠檬年 4 月 3 日 年 12 月 7 日 国药集团 甲醇 、、蛋白酶 SRE000510109517001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
  2. Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

In Situ HybridizationSipunculus NudusCoelomic FluidRiboprobe PreparationAntibody IncubationColor DevelopmentTissue SectioningGene Expression AnalysisDigoxigenin LabelingAlkaline Phosphatase Staining

Related Articles