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Immunology and Infection

유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화

Published: April 29, 2020 doi: 10.3791/61048
Automatic Translation
1, 1
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

Summary

이 프로토콜의 목적은 진핵 병원체 인간 노로바이러스의 결합을 박테리아에 정량화하는 것이다. 초기 바이러스-박테리아 부착 분석을 수행한 후, 유동 세포측정은 집단 내에서 바이러스 결합 박테리아를 검출하는 데 사용된다.

Abstract

생균은 진핵 바이러스의 감염에 영향을 미치기 위하여 잘 설치됩니다. 병원체와 숙주 미생물군유전체 사이의 직접 결합은 이러한 바이러스의 많은 감염을 변경하는 책임이 있다. 따라서, 바이러스-박테리아 결합의 특성화는 박테리아가 바이러스 감염을 변화시키는 메커니즘(들)을 해명하는 데 필요한 기초 단계이다. 인간 노로 바이러스에 대 한, 연구용 박테리아 B 세포 감염을 향상. 바이러스는 직접 이러한 박테리아에 바인딩, 이 직접 적인 상호 작용 감염 향상의 메커니즘에 관여 하는 것을 나타내는. 방사성 표지된 바이러스 및 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 주식 계수를 포함하여 박테리아와 바이러스 간의 상호 작용을 정량화하는 데 다양한 기술을 사용할 수 있습니다. 두 방법 모두 실험실에서 생성해야 할 수도 있는 살아있는 바이러스의 사용을 필요로 합니다. 현재, 인간 노로바이러스에 사용할 수 있는 체외 배양 시스템 중 어느 것도 고농축 바이러스 성 주식의 생성을 허용할 만큼 충분히 견고하지 않다. 살아있는 바이러스 대신에, 바이러스 같이 입자 (VLPs)는 노로바이러스와 박테리아 사이 상호 작용을 특성화하기 위하여 이용되었습니다. 본 명세서에서 유동 세포분석 방법은 그람 음성 및 그람 양성 박테리아에 VLP 결합을 정량화하기 위해 바이러스 특이적 항체를 사용하여 기술된다. 박테리아 만 및 이소형 대조군 모두의 포함은 시험된 박테리아에 대한 VLP 부착의 배경 항체 결합 및 정확한 정량화를 감소시키기 위해 분석법의 최적화를 허용하였다. 높은 VLP: 박테리아 비율은 세균 인구의 큰 비율에 결합하는 VLPs 귀착됩니다. 그러나, VLP 수량 감소 하는 경우, 결합 하는 박테리아의 백분율 또한 감소. 궁극적으로, 이 방법은 노로바이러스:세균 상호 작용을 조절하는 특정 조건 및 구조적 구성 요소를 해명하는 향후 실험에 사용될 수 있다.

Introduction

인간 노로바이러스(HuNoVs)는 전 세계적으로 위장병의 주요 원인으로,매년6억 8,500만 건의 감염과 200,000명 이상의 사망을 초래합니다. 다른 장내 바이러스와 마찬가지로, 동보 박테리아의 존재는 이 병원체뿐만 아니라 대리 바이러스, 뮤린 노로바이러스2,,3의감염을 향상시키는 것으로 나타났다. 박테리아가 인간 노로 바이러스4,,5,,6에의한 감염을 억제 할 수 있다는 충돌보고서가 있습니다. 여러 바이러스의 경우, 바이러스와 박테리아 간의 직접적인 상호작용은 바이러스감염에영향을 미치는 메커니즘의 근간을 이룬 것으로 나타나며2,7,,8,,9,,10,전자 현미경을 통해 인간 노로바이러스가 박테리아11,,12의표면에 직접 결합하는 것으로 나타났다. 그러므로, 이 상호 작용을 특성화하는 것은 박테리아가 바이러스성 감염에 영향을 미치는 기계장치를 결정하는 것이 중요하게 되었습니다. 이러한 특성화는 숙주 미생물군유전체7,,12,,13의성분인 세균종의 배열에 대한 바이러스 결합을 정량화하는 것으로 고전적으로 시작되었다. 이 첨부 성 분석은 박테리아에 묶인 바이러스의 양을 밝힐 뿐만 아니라 바이러스 적합성 및 생존에 이 상호 작용의 충격을 결정하는 것을 돕습니다.

바이러스 부착을 정량화하기 위해, 전통적으로 채택된 방법은 바이러스 게놈12 또는 방사성 표지된 바이러스의 생성을 정량화하는 PCR 기반 측정법을 포함하고 있으며, 바이러스입자를정량화하기 위해 분신계계의 사용7,8,,9,,13. 이러한 방법의 사용은 일반적으로 높은 티터 바이러스 주식과 그들을 생성하는 시험관 내 재배 기술에 대한 액세스를 필요로한다. 인간 노로 바이러스에 대한 여러 배양 시스템은 지금 존재하지만2,,14,15,아무도 제한하거나 인간의 노로 바이러스 / 세균 상호 작용을 정량화하기 위해 PCR 및 종축 계수의 사용을 제거 이러한 고농축 주식을 생성하는 데 필요한 강력한 복제를 지원하지 않습니다.14

이 문제를 우회하기 위해, 바이러스 유사 입자(VLPs)는 인간 노로바이러스와박테리아(16,,17)사이의 상호작용을 조사하기 위해 바이러스를 살리기 위해 대리로 사용될 수 있다. VLPs는 밀접하게 그(것)들이 파생되는 바이러스를 닮은 비 감염성 입자입니다. 인간 노로바이러스의 경우, 이들 입자는 유전물질이 결여된 손상되지 않은 바이러스 성 캡시드(즉, 노로바이러스를 위한 RNA)를 만들기 위해 자가 조립하는 VP1(및 언젠가 VP2) 단백질의 발현으로부터 생성된다. 이들 VLP는 잘 특징지어지고 있으며, 구조적으로 그리고 항원적으로 유사하며, 이들은,18,19,,20,,21,,22,,23에서유래되는 야생형 바이러스와 유사하다. 따라서, VLP는 인간 노로바이러스와 공생 박테리아 사이의 표면 상호 작용을 조사하기위한 이상적인 대리역할을합니다. VLPs는 유전 물질이 부족하다는 것을 감안할 때, PCR 기지를 둔 세포는 바이러스성 결합을 정량화하기 위하여 이용될 수 없습니다. 항체 기반 유동 세포분석 방법은 이전에 설명되었고 반정량적인 방식으로 박테리아에 결합하는 낮은 수준의 VLP를 검출할 수있었다 16. 이 방법은 그람 음성 및 그람 양성 공생박테리아(16)에결합하는 인간 노로바이러스 VLP의 정확한 정량화를 허용하도록 최적화되었다.

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Protocol

참고: 프로토콜에 설명 된 세균 성장 조건은 Enterobacter cloacae 및 유산 균 gasseri에대 한 표준 배양 조건. 바이러스를 수행하기 위하여:박테리아 부착 분석은 그밖 세균종으로, 선택된 박테리아는 박테리아를 위해 적당한 표준 조건 하에서 배양되어야 합니다.

1. 세균 성장 배지 준비

  1. 엔테로박터 클로아카성장매체
    1. 디이온화(DI) 물 1L에 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, 염화나트륨 10g(NaCl)을 용해시켜 액체 배지를 준비합니다(재료 표참조). 모든 매체를 완전히 혼합하고 30 분 동안 오토 클레이브하여 살균하십시오.
    2. 트립톤 10g, 효모 추출물 5 g, NaCl 10 g, 한천 15g을 DI 물 1L에 녹여 단단한 배지를 준비합니다. 모든 매체를 완전히 혼합하고 30 분 동안 오토 클레이브하여 살균하십시오.
  2. 유산 균 가스 세리 성장 매체
    1. 디맨, 로고사, 샤프(MRS; 재료표참조) 분말 55 g을 DI 물 1L에 녹여 액체 배지를 준비합니다. 준비 후 1개월 이내에 중간 크기로 사용하십시오. 살균하려면 끓일 때까지 15 분 동안 가열한 다음 15 분 동안 오토 클레이브를 하십시오.
    2. MRS 파우더 55 g과 한천 15g을 DI 물 1L에 녹여 단단한 배지를 준비합니다. 살균하려면 끓일 때까지 15 분 동안 가열한 다음 15 분 동안 오토 클레이브를 하십시오.

2. 광학 밀도(OD) 및 박테리아 농도와 상관관계가 있는 표준 곡선 설정

  1. 한천판(E. cloacae)으로부터단일, 단리콜로카로 또는 냉동 글리세롤스톡(L. gasseri)으로부터직접 5 mL의 적절한 액체 배지를 접종하였다.
  2. 박테리아를 하룻밤 동안 성장, 적절한 대기 조건 하에서(Enterobacter cloacae: 37 °C 에서 에어로빅 흔들림 200 rpm; L. gasseri: 밀폐 용기에 흔들림없이 37 ° C 수조).
  3. 10,000 x g에서 10,000 x g에서 2 개의 분리 된 1.5 mL 원심 분리 튜브 및 원심 분리 박테리아를 5 분 동안 두 개의 분리 된 1.5 ml 배양으로 하룻밤 배양2 x 1.3 mL aliquots를 옮긴다.
  4. 상급체를 제거하고 멸균 1x 인산염 완충 식염수 (PBS)의 1 mL로 샘플을 씻어. 이 세척 단계를 반복하여 총 2번 세척합니다.
  5. 샘플을 10,000 x g에서 5 분 동안 다시 원심 분리하고 상류를 제거하고 멸균 1x PBS 의 1.3 mL에서 다시 일시 중단하십시오.
  6. 세척 배양의 0.5 mL로 시작하여10-1에서 10-4까지1x PBS에서 박테리아를 연속적으로 희석시다.
  7. 분광광도계를 사용하여 세척되고 희석되지 않은 배양물의 광학 밀도를 측정하고 각각 600 nm(OD600)에서4개의 희석을 측정하였다.
  8. 2.6단계에서 각 희석에 대해 1x PBS로 10배 직렬 희석을 수행합니다. 각 계열에 대한 마지막 3개의 희석물의 플레이트 100 μL을 적절한 고체 배지상에 확산하여 각 샘플의 밀리리터(CFU/mL)당 콜로니 형성 단위의 수를 결정하였다. 각 희석을 삼중으로 플레이트합니다.
  9. 플레이트가 실온에서 5 분 동안 건조되도록 하십시오. 플레이트를 반전시키고 적절한 대기 조건하에서 배양하십시오(E. cloacae: 37 °C에서 호기성, 밤새 배양 플레이트; L. gasseri: 37 °C에서 혐기성, 혐기성 공기 봉지와 밀폐 용기에 48 시간 동안 배양 플레이트 (재료 표참조).
    참고: 2.5L 병당 혐기성 공기 봉지 1개 또는 7.0L 병당 3봉지를 사용하십시오(재료 표참조).
  10. 플레이트 카운트를 사용하여 5개의 샘플 각각에 대해 CFU/mL을 결정합니다(즉, 원액,10-1, 10-2,-210-3,10-4). OD600 과 CFU/mL을 비교하는 표준 곡선을 생성합니다. 이 라인에 대한 방정식은 Od600에기초하여 CFU /mL을 결정하기 위해 VLP 박테리아 부착 분석은 사용됩니다.

3. VLP 박테리아 부착 분석

주의: 인간 노로바이러스 VLP는 생물안전수준(BSL)-2의 위험요소이며, VLP와 관련된 모든 작업은 생물안전성 캐비닛에서 수행해야 합니다. 부착 분석 전에 세균 배양물의 준비는 유기체에 적합한 안전 조건을 사용하여 수행되어야한다.

  1. 시약 준비
    1. 1x 인산염 완충 식염수 (PBS)
      1. DI 물 1L에 전체 패킷을 용해시켜 10x PBS 1L를 준비합니다.
      2. 30 분 동안 오토 클레이브 솔루션.
      3. 상기 용액을 DI 물에서 1:10희석하여 1x용액을 준비한다.
      4. 0.22 μm 필터를 통과하여 용액을 살균하고 실온에서 보관합니다.
    2. 5% BSA
      1. 5% (w/v) 용액을 생성하기 위해 PBS 100 mL에 소 혈청 알부민 (BSA) 분말 5 g을 추가합니다.
      2. 덩어리가 용해 될 때까지 금속 교반 막대를 사용하여 소용돌이 또는 교반 판에 용액을 혼합합니다.
      3. 0.22 μm 필터를 사용하여 필터 살균.
      4. 용액을 4°C에 보관하십시오.
    3. 유세포분석염색 버퍼(FCSB)
      1. 0.22 μm 필터를 통해 구입한 FCSB(재료 표참조)를 필터링합니다.
      2. 남은 용액을 4°C에 보관하십시오.
    4. 5% 블로킹 버퍼 (BB)
      참고: 매번 신선을 준비하세요.
      1. 멸균 FCSB 10 mL에 BSA 0.5 g을 추가합니다.
      2. 소용돌이는 샘플을 완전히 혼합하고 사용할 때까지 얼음에 둡니다.
  2. 항체 컨쥬게이션
    1. 인간 노로바이러스 GII 항체(재료 표참조)와 R-PHYcoerythrin(PE)을 제조자의 지시에 따라 R-PE 항체 라벨링 키트를 사용하여 컨쥬게이트(재료 표참조).
    2. VLP-박테리아 부착 분석 분석에서 향후 사용을 위해 4°C에서 공액 항체를 어둠 속에서 저장한다.
      참고: 1차 항체는 유세포 분석 분석에 필요한 적절한 농도를 결정하기 위해 VLP-박테리아 부착 분석에서 사용하기 전에 적정되어야 한다. 항체 적정은 부착 분석에서 사용되는 각각의 박테리아에 대해 활용 반응이 수행될 때마다 수행되어야 한다.
  3. 항체 적정
    1. 공액된 인간 노로바이러스 GII 항체를 100배 희석시키고, 1:100의 시작 희석과 1:600의 결말 희석(총 6개의 희석)을 희석한다.
    2. 다음 예외로 아래에 설명된 바와 같이 바이러스 부착 분석을 수행한다: 3.5.7 단계에서 5% BB의 350 μL에서 세균 펠릿을 재중단한다.
    3. 샘플을 7개의 50 μL aliquots로 나눕니다.
    4. 각 항체 희석의 50 μL을 하나의 튜브에 추가합니다.
    5. 얼룩지지 않은 대조군으로 7번째 튜브에 5% BB의 50 μL을 추가합니다.
    6. 아래에 설명된 대로 모든 샘플에서 유량 세포측정을 수행합니다.
    7. 희석된 항체 샘플을 얼룩지지 않은 대조군과 서로 비교합니다. 양성 신호의 감소 또는 손실을 초래하지 않는 가장 낮은 항체 농도는 후속 측정에 사용하기 위해 선택되어야한다.
  4. 박테리아의 준비
    1. 박테리아가 고정 단계에 때까지 적절한 대기 조건하에서 적절한 액체 매체의 40 mL에서 박테리아를 성장.
      1. 37°C에서 루리아 국물에서 밤새 에어로빅으로 E. cloacae 배양물을 성장시키고, 200 rpm에서 흔들어 고정된 단계에 도달합니다.
      2. 37°C로 설정된 수조에서 흔들리지 않고 검은 스크류 캡 튜브로 MRS 국물에서 L. gasseri 배양을 성장시키고 18시간 동안 고정된 단계에 도달한다.
    2. 고정상 배양액을 50 mL 원점 튜브 및 원심분리기 샘플을 2,288 x g에서 10분 동안 세척하여 박테리아를 펠렛합니다.
    3. 상급체를 제거하고 멸균 1x PBS 13 mL로 다시 일시 중단하십시오. 이 세척 단계를 반복하여 총 2번의 세척을 반복합니다.
    4. 샘플을 다시 원심분리하고 상급체를 제거하고 1x PBS의 20 mL에서 샘플을 다시 일시 중단합니다.
      참고: 셀 펠릿이 작으면 재서스펜션 부피를 감소시킬 수 있습니다.
    5. 배양의 OD600을 측정합니다.
    6. 이전에 준비된 표준 곡선을 사용하여 세척된 배양물의 mL당 CFU를 결정합니다.
    7. 1x PBS로 필요에 따라 박테리아를 희석하여 배양 농도를 1 x 108 CFU/mL로 조정합니다.
    8. 1 x 108 CFU/mL 세균 배양물의 1 mL을 필요한 수의 1.5 mL 원심분리기 튜브로 옮김을 전달합니다.
    9. 튜브를 10,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
    10. 멸균 5% BSA의 1 mL에서 세균 펠릿을 다시 중단하십시오.
    11. 일정한 회전으로 37 °C에서 1 시간 동안 튜브를 배양합니다.
  5. 바이러스 첨부 파일
    1. BSL-2 생체 안전 성 캐비닛 내부에서 작업, HuNoV VLP의 10 μg를 추가 (재료의 표참조) PBS에 다시 일시 중단 박테리아를 포함 하는 각 튜브에 하 고 파이펫팅에 의해 철저 하 게 혼합.
      참고: VLP 농도는 각 VLP 준비마다 다릅니다. 따라서 박테리아에 첨가된 부피는 제제 배치마다 다양하며 실험에서 각 튜브에 10 μg가 첨가되도록 그에 따라 조정되어야 한다. 박테리아 만 대조군 (예를 들어, VLP가없는 샘플)의 경우 실험 샘플에 추가 된 VLP의 부피와 동일한 PBS 볼륨을 추가하십시오.
    2. 일정한 회전으로 37 °C에서 1 시간 동안 튜브를 배양하십시오.
      참고: 튜브 리볼버(재료 표참조)는 인큐베이션 중에 40rpm으로 설정됩니다.
    3. 배양 후, 샘플을 10,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
    4. 상급을 버리고 PBS 의 1 mL에 세균 성 펠릿을 다시 중단하십시오.
    5. 세척 단계 3.5.3 및 3.5.4를 반복합니다.
    6. 샘플을 10,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
    7. 상급을 버리고 5 % BB의 150 μL에서 세균 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
  6. 항체 염색
    1. 신선한 5% BB를 준비합니다.
      참고 : 형광 태그 항체를 사용하는 모든 작업은 어둠 속에서 수행되어야하며 항체, BB 및 FCSB는 얼음위에 보관해야합니다.
    2. 인간 노로바이러스 GII 항체를 E. cloacae 시료의 경우 1:125, L. gasseri 시료의 경우 5% BB에 1:150을 희석하여 시료당 50 μL의 희석된 항체를 준비합니다.
    3. 인간 노로바이러스 GII 항체를 5% BB에서 각 박테리아에 대해 희석한 것과 같은 방식으로 이소형 항체를 희석하고, 샘플당 50 μL의 희석된 이소타입 대조군을 준비하였다.
    4. 각 부착 분석 샘플을 3.3.7 단계에서 3개의 50 μL aliquots로 나누어 깨끗한 1.5 mL 원심분리기 튜브로 옮김을 전달합니다.
    5. 샘플의 첫 번째 세트에 BB 50 μL을 추가합니다. 이 집합은 스테인드되지 않은(Uns) 컨트롤입니다.
    6. 제2 세트에, GII 항체 희석의 50 μL을 첨가한다. 이로 인해 최종 항체 농도는 E. cloacae의 경우 1:250, L. gasseri의경우 1:300입니다. 이 샘플 세트는 스테인드(AB) 샘플이 될 것이다.
    7. 세 번째 세트에 희석된 이소타입 항체의 50 μL을 첨가한다. 이 집합은 아이소타입 컨트롤(IC)이 됩니다. 파이펫팅으로 잘 섞으세요. 샘플을 얼음과 어둠 속에서 30 분 동안 배양합니다.
    8. 원심분리기 는 5 분 동안 10,000 x g의 모든 샘플을 채우지 않습니다.
    9. 상급체를 버리고 FCSB의 100 μL에서 샘플을 다시 중단합니다.
    10. 모든 샘플을 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리기. 상급체를 버리고 FCSB의 100 μL에서 샘플을 다시 중단합니다.
    11. 원심분리기 는 5 분 동안 10,000 x g의 모든 샘플을 채우지 않습니다.
    12. 상급체를 버리고 FCSB의 150 μL에서 샘플을 다시 중단합니다.
    13. 각 샘플을 총 부피 550 μL에 대해 400 μL의 FCSB 버퍼를 함유하는 FCSB 튜브로 옮김.
    14. 시료가 유세포분석으로 분석될 때까지 샘플을 4°C로 유지합니다.
      참고 : 유세포 측정은 항체 염색 의 4 시간 이내에 수행됩니다.

4. 유세포분석

참고: 아래에 설명된 전압 설정은 재료 표에 나열된 유량 세포계 및 소프트웨어를 기반으로 하며 유동 세포계에 따라 다를 수 있습니다. 설정은 각 박테리아에 대해 최적화되어야 합니다. 모든 그래프의 축이 비xponential 단계에 있는지 확인합니다.

  1. 작업 영역 설정
    참고: 작업 공간을 설정하는 데 사용되는 플롯의 설정은 게이팅 및 데이터 분석에 사용되는 설정과 다릅니다. 작업 공간을 설정하는 목적은 세포 집단을 시각화하고, 다운스트림 분석에 영향을 줄 수 있는 세균 세포의 과도한 응집이 없는지 확인하고, 데이터가 수집되는 동안 염색된 세포와 얼룩지지 않은 세포를 구별하는 것입니다.
    1. 박테리아가 함께 뭉치지 않도록 하기 위해 일련의 밀도 플롯을 설정합니다.
      1. 전체 모집단을 시각화하기 위해 전방 분산 영역(FSC-A) 대 측면 분산 영역(SSC-A)을 생성합니다.
      2. 순방향(FSC-W) 및 측면 산란 폭(SSC-W)과 순방향(FSC-H) 및 측면 산란 높이(SSC-H)를 각각 비교하는 두 개의 그래프를 만들어 단일 셀과 셀 덩어리를 평가하기 위해 플롯을 설정합니다.
      3. PE 양수 모집단만 표시하는 플롯을 만듭니다(PE-A 대 SSC-A).
    2. 기준 전압을 E. cloacae의 경우 500, L. gasseri의경우 340으로 설정합니다. 이 것들은 나중에 추가로 조정될 것입니다.
    3. 집계된 총 이벤트를 10,000개의 이벤트로 설정합니다.
  2. 샘플 실행
    1. SSC-A, FSC-A 또는 PE-A에 대해 플롯된 수를 표시하는 세 개의 별도의 히스토그램 플롯을 만듭니다.
    2. 유량 세포계에 얼룩이 없는 샘플을 놓고 샘플 이벤트를 획득하여 SSC-A의 히스토그램의 최대 피크가 102 ~ 103 이내이고 FSC-A의 히스토그램의 최대 피크가 x축에서 104 ~ 105 사이임을 확인합니다. 그렇지 않은 경우 피크가 지정된 범위 내에 있지 않으면 FSC 및 SSC 전압을 적절하게 조정합니다.
    3. 유량 세포계에 스테인드 샘플(AB)을 놓고 전압 PE를 조정하여 x축에서 최대 피크가 103을 넘도록 합니다.
    4. 이러한 측정을 기반으로 양수 PE 게이트를 설정하고 PE-A 대 SSC-A 밀도 그래프에서 게이트를 설정합니다.
    5. 모든 샘플을 낮은 또는 중간 속도로 결정된 설정에서 실행합니다.

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Representative Results

공생 박테리아에 결합하는 인간 노로바이러스 VLP를 정량화하는 데 사용되는 게이팅 전략은 도 1에나타내었다. 대표적인 밀도 도트는 VLP 부착이 단일 집단에서 결정되도록 세포 파편 및 세포 덩어리를 제거하기 위해 시료를 문게 한 방법에 대한 개요를제공합니다(그림 1A). 대표적인 히스토그램은 이소형 조절 항체로 염색된 VLP-박테리아 시료의 노로바이러스 VLP 및 낮은 배경 신호가 결여된 시료에서만 항노로바이러스 항체 신호의 낮은 수준을 입증한다(도1B). 이소타입 제어 피크는 또한 얼룩이 없는 샘플과 겹치면서 동일한 시료를 반인간 노로바이러스 GII 항체로 염색하면 피크에서 상당한 변화가 발생합니다.

히스토그램 빼기의 Overton 방법은 항인간 노로바이러스 GII 항체 염색 샘플에서 PE 양성 신호를 상응하는 이소형 대조군의 PE 양성 신호와 비교하고 인간 노로바이러스 VLp에 의해 결합된 세균 집단의 백분율을 결정하는 데사용되었다(도 1B). VLP의 10 μg를 가진 배양의 1 시간 후에, 유동 세포측정은 E. cloacae 및 L. gasseri 둘 다에 입자 결합을 검출했습니다(그림 2). 사실, 바인딩의 높은 수준의 두 박테리아에 대 한 이러한 조건 하에서 발생; L. gasseri에 결합은 E. cloacae에 비해 약간 더 높았지만 유의한 (p < 0.0001) 수준에서 발생했습니다. 이 분석은 유세포측정이 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 둘 다에 결합하는 인간 노로바이러스를 검출하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여줍니다.

이러한 분석에 대한 결합 정량화의 한계를 결정하기 위해, VLP의 희석 계열은 박테리아에 첨가하기 전에 생성되었다(도3). 박테리아의 두 genera에 대 한, 세균 배양에 추가 하는 VLP의 양감소 VLP에 의해 바인딩된 박테리아의 백분율에 해당 감소 귀착되. 입자에 의해 결합 된 E. cloacae의 백분율의 변화는 L. gasseri에비해 더 점진적이었다, 하지만 두 박테리아에 대한 퍼센트 부착은 VLP 농도의 추가 감소에도 불구하고 평준화. 구체적으로, 박테리아의 108 CFU에서 VLP의 0.1 μg 이하 (데이터는 도시되지 않음)는 이 비율이 이 분석에 대한 정량화의 한계임을 나타내는, 두 박테리아 에 대해 평균 13-19% 사이의 퍼센트 부착의 고원을 초래했다.

Figure 1
도 1: 인간 노로바이러스 VLP 결합의 대표적인 유세포 분석. (A)대표적인 유동 세포분석 게이팅 전략으로 박테리아에 대한 VLP 결합을 정량화한다. 밀도 플롯은 세포 파편을 게이트하는 데 사용되었고, 그 다음에는 세균이 더블룸과 셀룰러 덩어리를 제거하기 위해 연속적인 도트 플롯 게이팅을 사용했습니다. (B)대표적인 히스토그램은 세균 전용 샘플에서 PE 신호의 부족과 VLP:박테리아 샘플에서의 PE 신호 강도의 변화가 얼룩지지 않은 및 이소타입 대조군과 비교된다는 것을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: E. 클로아카및 L. 가세리에대한 VLP 부착. E. cloacae (n = 6) 및 L. gasseri (n = 6)의 하룻밤 배양은 PBS에서 1 x 108 CFU/mL로 희석하였다. 박테리아를 10 μg의 GII.4 VLP로 1시간 동안 배양한 다음 VLP 부착물을 유세포분석기를 사용하여 측정하였다. 대표 플롯은 그림 1B에서찾을 수 있습니다. 백분율 부착은 GII 인간 노로바이러스 염색 샘플의 PE 양성 신호를 상응하는 이소형 대조군의 PE 양성 신호와 비교하는 히스토그램 빼기의 Overton 방법을 사용하여 결정하였다. 통계 분석은 짝이 없는 학생의 t-검정(p< 0.0001)을 사용하여 수행하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: E. cloacae 및 L. gasseri에대 한 VLP 희석 시리즈. GII.4 VLP의 10 μg를 직렬로 희석하고 VLP 희석을 각각 1 mL의 최종 부피에서 1 x 108 박테리아에 첨가하였다(n=3 두 박테리아 모두). 샘플을 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 박테리아에 대한 VLP 부착물을 유세포분석기를 사용하여 측정하였다. 백분율 부착은 GII 인간 노로바이러스 염색 샘플의 PE 양성 신호를 상응하는 이소형 대조군의 PE 양성 신호와 비교하는 히스토그램 빼기의 Overton 방법을 사용하여 결정하였다. VLP의 입력량을 줄이면(A) Cloacae 및(B) L. gasseri모두에 대한 퍼센트 부착의 단계적 감소를 초래하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

박테리아에 장바이러스의 결합을 정량화하는 기능은 이 박테리아가 바이러스성 감염을 바꾸는 기계장치를 해명하기 위한 중요한 첫번째 단계입니다. 본 명세서에 기재된 방법은 인간 노로바이러스 VLP 상호작용을 E. 클로아카(gram-negative 박테리아) 및 L. gasseri(그람 양성 박테리아)와 측정하도록 최적화되었지만, 임의의 포유류 바이러스 및 관심 있는 박테리아와 함께 사용하도록 적응될 수 있다. VLPs는 부착 분석에서 사용하기 위한 살아있는 바이러스에 대한 이상적인 대안이며 이들 입자는 유세포 분석기를 사용하여 쉽게 정량화될 수 있지만, P 입자는 또한 인간 노로바이러스와박테리아(24)사이의 상호작용을 조사하기 위해 사용되어 왔다. 이 연구에서는, 박테리아에 결합된 바이러스의 양은 세균 집단과 반대로 정량화되었다, 여기에서 보고되는 바와 같이. P 입자는 VLP 및 야생형바이러스(24,,25)에항원 유사성을 제공하면서 생산하기 쉽다는 점에서 VLP에 비해 이점을 제공한다. 그러나, 인간 노로바이러스 VLP는 VLP 또는 P 입자를 생성할 수 있는 능력이 부족한 실험실을 위한 수단을 제공하는 상업적으로 이용된다. P 입자는 VLP와 다르다는 점에서, VLP는 야생형 바이러스 입자의 크기를 유지하면서, P 입자는 더 작고 사위대칭이 아닌사위대칭(25)을갖는다. 박테리아와의 상호 작용에 이러한 특성의 영향 탐험 되지 않은 및 P 입자 인간 노로 바이러스와 박테리아 사이의 표면 상호 작용을 특성화에 VLPs에 실행 가능한 대안으로 봉사할 수 있습니다.

앞서 언급한 바와 같이, 전술한 분석은 인간 노로바이러스 VLP와 박테리아 사이의 상호작용을 더욱 특성화하는데 사용될 수 있다. 세균 표면 구조 표현에 있는 성장 조건 그리고 변경이 바이러스성 결합을 바꾸는 방법에 대한 조사는 이 기술을 사용하여 탐구될 수 있습니다. 또한, 이러한 분석법은 또한 세균 단백질 또는 글리칸을 이용한 경쟁억제 분석, 특정 표면 구조를 제거하는 효소 처리, 또는 돌연변이 세균 균주가 결핍된 구조로 인큐베이션을 통해 바이러스에 의해 결합된 특정 세균 구조를 결정하는데 사용될 수 있다. 이 분석은 또한 다른 노로 바이러스 균주가 동보 박테리아와 상호 작용하는 능력을 조사하기 위해 사용될 수 있습니다.

이 분석법은 노로바이러스 VLP에 의해 결합된 세균 집단의 비율을 정량화하기 때문에, 세균 배양 농도가 측정될 수 있도록 CFU/mL과 OD600 사이의 상관관계를 정확하게 결정하는 것이 중요합니다. VLP에 있는 동요: 박테리아 비율은 VLP에 의해 묶인 박테리아 인구의 백분율을 바꾸고 결과에 있는 가변성으로 이끌어 낼 수 있습니다. 이 분석의 검출한계가 박테리아의 VLP/108 CFU의 0.1 μg에 접근하기 때문에, 바이러스 성 입자의 충분한 양을 추가하기 위하여 주의를 기울여야 합니다. 이 한도 미만의 비율은 일관되게 13-19%의 부착 값을 산출했습니다. 따라서 이 백분율 이하의 관찰된 집단 부착은 실재하지 않을 수 있다.

항체 적정은 VLP:박테리아 부착 실험에서 사용하기 전에 각 새로 공액된 항체 및 각 세균 균주에 대해 수행되었다. 각 박테리아에 필요한 항체 농도는 E. cloacae에 대해 1:250, L. gasseri의경우 1:300에 이르기까지 유사했다. 진핵 세포의 크기에 비해 박테리아의 작은 크기는, 샘플에서 찾아질 수 있는 파편에서 박테리아를 적당하게 분리하기 위하여 데이터 수집 도중 전압 조정 및 이항 분포의 사용 둘 다 필요하거나 계측기 내의 순환. 데이터 수집 후, 적절한 게이팅을 사용하여 더 큰 이물질 입자와 세균 덩어리를 제거하여 단일 세포 집단만 분석할 수 있습니다. 또한 이러한 변동으로 테스트 각 세균 종에 대 한 독특한 전압 설정을 설정 하는 것이 중요 하다, 특히 그 람 음성 및 그람 양성 박테리아 사이.

박테리아만 및 등유형 제어를 포함한 적절한 제어를 포함하는 것도 데이터의 정확한 분석을 위해 중요합니다. 두 가지 유형의 대조군 모두 비특이적 항체 결합의 수준에 관하여 알려. 우리의 결과는 시험된 세균성 종에 비특이적 결합하지 않기 위하여 이용된 항체가, 그러나 비특이적인 결합이 세균성 종 또는 항체에 있는 변경으로 변경될 수 있었다는 것을 보여줍니다.

여기에 제시된 방법은 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 모두에 인간 노로바이러스 입자 결합을 정량화하고 바이러스:세균 상호 작용을 특성화하는 데 유용합니다. 더욱이, 이 염기 프로토콜은 인간 노로바이러스의 다른 유전자형뿐만 아니라 다른 포유류 바이러스 및 박테리아와 함께 사용하기 위해 쉽게 최적화될 수 있다.

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Disclosures

저자는 이해 관계의 충돌이 없습니다.

Acknowledgments

수토누카 바르와 샤넬 모스비-하운드루프가 작성된 원고에 대한 비판적 검토와 세균 표준 곡선 생성에 도움을 준 알폰소 카릴로에게 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소에서 보조금에 의해 부분적으로 자금 (R21AI140012) 플로리다 대학에서 종자 보조금에 의해, 식품 및 농업 과학 연구소.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap Corning 352235 After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.
Agar Sigma A7002 Used for media preparation
AnaeroPack Thermo Scientific R681001 Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa flow cytometer
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1605 Used for flow cytometry
Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) BD Biosciences 554657 Used for flow cytometry
Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience Thermo Fisher Scientific 12473281 Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.
MRS Powder BD Biosciences 288130 Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.
Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) Thermo Fisher Scientific MA5-18241 Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.
Norovirus GII.4 VLP Creative Biostructure CBS-V700 human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.
PBS 10X Fisher Bioreagents BP665 Dilute to 1X prior to use.
SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit Thermo Fisher Scientific S10467 Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Used for media preparation
Tryptone Oxoid LP0042 Used for media preparation
Tube Revolver ThermoFisher Scientific 88881001 Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).
Yeast Extract BD Biosciences 212750 Used for media preparation

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References

  1. Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
  2. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  3. Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
  4. Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017 (2016).
  5. Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).
  6. Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559 (2017).
  7. Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
  8. Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
  9. Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
  10. Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).
  11. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  12. Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
  13. Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
  14. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  15. Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).
  16. Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).
  17. Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).
  18. Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
  19. Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
  20. Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
  21. Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
  22. Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), New York, N.Y. 287-290 (1999).
  23. Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
  24. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).
  25. Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).

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면역학 및 감염 문제 158 인간 노로바이러스 장내 바이러스-세균 상호 작용 공생 박테리아 인간 노로바이러스 정량화 인간 노로바이러스 검출 바이러스 박테리아 부착
유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화
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Madrigal, J. L., Jones, M. K.… More

Madrigal, J. L., Jones, M. K. Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (158), e61048, doi:10.3791/61048 (2020).

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