聚焦超声结合微泡造影剂可实现血脑屏障的局部和短暂开放。该技术已被用于递送多种物质通过血脑屏障。本文提供了一种在有或无磁共振成像（MRI）引导下，向啮齿类动物脑部进行局部递送的详细实验方案。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
立体定向手术是向啮齿类动物脑部进行局部药物和基因递送的金标准。与全身给药相比，该技术具有多种优势，包括可精确定位至目标脑区，并减少脱靶副作用。然而，立体定向手术具有高度侵入性，限制了其转化应用效果，需要较长的恢复时间，且在靶向多个脑区时面临挑战。聚焦超声（FUS）可与循环微泡联用，以瞬时开放血脑屏障（BBB），开放区域可达毫米级别。这使得原本无法穿过血脑屏障的全身递送药物能够定位于颅内特定区域。该技术为立体定向手术提供了一种非侵入性的替代方案。然而，迄今为止，由于设备获取困难以及缺乏标准化方法，该技术尚未在神经科学研究实验室中得到广泛应用。本实验方案的总体目标是提供一种经济、可重复的台式FUS血脑屏障开放（BBBO）方法，使其能够被任何实验室轻松采用。
引言
尽管基础神经科学领域已取得诸多发现，但针对神经发育性和神经退行性疾病的新兴治疗方法仍然相对有限1,2。对参与神经系统疾病的相关基因、分子和细胞环路的深入理解，已提示了一些在现有技术条件下尚无法在人体中实现的潜在有效治疗策略3。有效的治疗手段常常受限于药物必须能够穿透血脑屏障并实现靶向特定部位的要求4,5,6,7,8。然而，目前针对特定脑区的局部给药方法（例如通过注射或导管给药）具有侵入性，且需要在颅骨上开孔9。此类手术的侵入性阻碍了局部给药在人类大脑中的常规应用。此外，组织损伤及其引发的炎症反应，普遍干扰了依赖脑内注射的基础研究和临床前研究10。若能实现非侵入性地将治疗剂穿过血脑屏障（BBB）并靶向特定脑区，不仅将极大推动神经系统疾病治疗的发展，同时也将为临床前研究提供一种强有力的探索工具。
一种....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有实验操作均按照阿拉巴马大学伯明翰分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）的指南进行。
1. 聚焦超声驱动设备的设置
- 使用 50 欧姆同轴 BNC 电缆连接：(1) 超声换能器的输入端至射频放大器的输出端；(2) 射频放大器的输入端至函数发生器的输出端。
- 将函数发生器模式设置为每秒一次正弦波脉冲串，占空比为 1%。
- 对于使用 50 dB 射频放大器的阻尼 1 MHz 低功率浸入式换能器（焦距为 0.8 英寸），起始参数设置为：1 MHz 正弦波，峰峰值电压 1 V，10k 个周期，间隔（或周期）1 s。
- 对于背衬为空气的 1.1 MHz 高功率换能器，初始参数设置为：1.1 MHz 正弦波，峰峰值电压 50 mV，11k 个周期，间隔 1 s。
注意：除非换能器已浸入液体中，否则不得运行。运行期间，切勿将手或其他身体部位置于超声焦点处，或接触换能器表面。
2. 聚焦超声台式装置设置
- 3D 打印立体定位架和立体定位架固定器。
- 使用夹具夹住 PVC 管，将换能器连接到 XYZ 位移平台（图 1a）。将夹具用螺栓固定在 X 轴滑块上，并用翼形螺母锁紧。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
此处，我们证明利用上述参数，结合低功率浸入式换能器，聚焦超声联合微泡可诱导血脑屏障的局部开放图3）以及FUS换能器（图4）。首先，在早期实验中，将低功率浸入式换能器对准大脑半球的前部（图3b）或内侧（图3a）。2小时后通过灌注处死动物（图3a) 或无灌注（图3b）和 10 µm 采集冷冻脑切片。通过EBD自发荧光（激发波长：470 和 540 nm，发射波长：680 nm）可观察到目标半球出现FUS诱导的血脑屏障开放（白色箭头） 图3a 和 3b).
为了通过EBD自发荧光清晰观察血脑屏障（BBB）的开放情况，我们发现对动物进行灌注以清.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文介绍了一种在实验台上进行微泡辅助聚焦超声（FUS）打开血脑屏障（BBB）的方法，并提供了替代方案，包括两种不同的换能器以及在有或无磁共振成像（MRI）引导下进行颅内靶向的方法。目前，为了在实验室中建立MRI引导的FUS BBB开放技术，可以选择购买性能优良、即插即用的设备，这些设备具有用户友好的界面，能够提供高度标准化且可重复的结果。然而，许多实验室难以承担此类仪器的高昂费用。因此，本方案的主要目标是为任何实验室提供一个可建立的起点，以逐步积累该技术的专业经验。
聚焦超声（FUS）开放血脑屏障（BBB）现已成为一种广泛应用的技术，不同研究团队常使用多种不同的造影剂和麻醉剂，而这些试剂均可能影响BBB开放的程度及血管外渗情况。尤其需要注意的是，所使用的特定麻醉剂可能会影响BBB开放的幅度，因此在执行本方案时必须对此加以考虑38。本文采用异氟烷作为麻醉剂，原因是动物可在异氟烷麻醉下维持整个实验过程，且可根据动物的呼吸频率和心率方便地调节异氟烷气体浓度。此外，我们使用氧气携带异氟烷进行给药，因其比医用空气更易获得；然而，医用空气可能有助.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究部分得到了美国国家科学基金会（NSF）EPSCoR研究基础设施资助（授予克莱姆森大学，编号1632881）的支持。此外，本研究还部分得到了阿拉巴马州伯明翰市国际Civitan研究中心的支持。作者衷心感谢阿拉巴马大学伯明翰分校小型动物影像共享设施资助项目［美国国立卫生研究院（NIH）P30 CA013148］所提供的服务与设施。作者感谢Rajiv Chopra提供的支持与指导。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 气泡振荡器 | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX，用于激活Definity微泡的激活装置 |
| 导管塞/注射帽 | SAI infusion technologies | 部件编号：IC | 导管塞/注射帽 |
| 伊文思蓝染料 | Sigma | E2129-10G | 伊文思蓝染料 |
| 函数发生器 | Tektronix | AFG3022B | 双通道，250MS/s，25MHz |
| FUS换能器，1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI兼容球面聚焦超声换能器，带水听器 |
| 小鼠和大鼠加热垫 | Kent Scientific | PS-03 | 加热垫 - 用于小鼠和大鼠的PhysioSuite |
| 输注泵 | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy单通道注射泵 |
| 聚酰亚胺胶带（Kapton胶带） | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 | Gizmo Dorks 聚酰亚胺胶带（Kapton胶带），适用于3D打印机和打印，8 x 8英寸，每包10张 |
| 低功率浸入式换能器，1MHz | Olympus | V303-SU | 浸入式换能器，1 MHz，元件直径0.50英寸，标准外壳类型，直式UHF连接器，F=0.80IN PTF |
| 磁铁组件 | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC | WINOMO 15mm 缝纫用磁性包扣，适用于缝纫和剪贴簿制作 - 10组 |
| 射频放大器 | E&I | A075 | 75W |
| 尾静脉导管 | BD | 382512/ Fisher货号：NC1228513 | 24G BD Insyte Autoguard防护型静脉导管（无翼） |
| 超声造影微泡 | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY（全氟丁烷脂质微球） |
| 超声耦合凝胶 | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P | 超声耦合凝胶 Aquasonic 100 传输凝胶 1升挤压瓶 |
| 带翼输液套件，22G | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo 带翼输液套件 |
| 电机控制器软件 | N/A | N/A | 使用LabView编写的自定义软件，用于控制Velmex电机控制器 |
| 电机控制器软件运行环境 | 国家仪器公司（National Instruments） | LabView运行引擎版本2017或更高版本 | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 三轴线性位移台（XYZ定位器） | Velmex | ||
| 螺栓 | Velmex | MB-1 | BiSlide螺栓 1/4-20x3/4" 内六角圆柱头螺钉（10个装），数量：3 |
| 电机控制器 | Velmex | VXM-3 | 控制器，三轴可编程步进电机控制，数量：1 |
| 安装夹板 | Velmex | MC-2 | 夹板，双孔BiSlide，数量：6 |
| 安装夹板 | Velmex | MC-2 | 夹板，双孔BiSlide，数量：2 |
| USB转串口转换器 | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB转RS232串行通信电缆 10英尺，数量：1 |
| X轴线性位移台 | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide，行程=10英寸，2 mm/转，限位开关，NEMA 23，数量：1 |
| X轴步进电机 | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2，单轴步进电机，数量：1 |
| Y轴线性位移台 | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide，行程=10英寸，2 mm/转，限位开关，NEMA 23，数量：1 |
| Y轴步进电机 | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2，单轴步进电机，数量：1 |
| Z轴阻尼器 | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL 阻尼器，适用于Type 23双轴步进电机，数量：1 |
| Z轴线性位移台 | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide，行程=10英寸，2 mm/转，限位开关，NEMA 23，数量：1 |
| Z轴步进电机 | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2，双轴步进电机，数量：1 |
| 可3D打印的文件 | |||
| 浸入式换能器支架和指针 | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| 立体定位仪框架 | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| 立体定位仪支架 | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T小孔径动物MRI系统 | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision 5.1版本 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| 乳霜型脱毛剂 | Church & Dwight | Nair乳霜 | |
| 钆布醇MRI造影剂 | Bayer | 加乐显（Gadavist，钆布醇，1mM/mL） | |
| 立体定位仪框架 | Stoelting | #51500 | 不适用于MRI |
| 即用型FUS递送装置 | FUS Instruments | RK-300 | 适用于啮齿类动物的即用型MRI兼容FUS系统 |
参考文献
- Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M. A., Tricklebank, M., Steckler, T. Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacology. 34 (1), 74-89 (2009).
- Schoepp, D. D. Where will new neuroscience therapi....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
