여기에 제시된 음향 분리기사용CHO세포배양의 1차 해명에 대한 프로토콜이 있다. 이 프로토콜은 쉐이크 플라스크 배양 또는 생물 반응기 수확의 1 차적인 설명을 위해 사용될 수 있고 관류 생물 반응기 작업 도중 세포 출혈 물질의 지속적인 설명을 위한 잠재적인 응용을 가지고 있습니다.
1차 해명은 수확된 세포 배양액 내에서 치료 제품으로부터 세포를 초기 제거하는 바이오 제조 공정에서 필수적인 단계이다. 원심분리 또는 여과와 같은 전통적인 방법은 세포 제거를 위해 널리 구현되지만, 이러한 프로세스의 장비는 큰 발자국을 가지고 있으며 작동에는 오염 위험과 필터 파울링이 포함될 수 있습니다. 또한, 전통적인 방법은 1 차적인 설명을 위한 연속적인 바이오 프로세싱 계획에 이상적이지 않을 수 있습니다. 따라서, 음향(sound) 파를 이용한 대체 어플리케이션은 세포 배양액으로부터 세포를 지속적으로 분리하는 것을 조사하였다. 본 연구에서 제시된 벤치 스케일 음향파 분리기(AWS)를 사용하여 CHO 세포 생물반응기 수확으로부터 단일클론 IgG1 항체를 함유하는 배양유체의 1차 분리를 위한 상세한 프로토콜이 있다. 대표적인 데이터는 AWS에서 제공되며 효과적인 셀 설명 및 제품 복구를 달성하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로 지속적인 바이오 프로세싱에서 AWS에 대한 잠재적 인 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 전반적으로, 이 연구는 CHO 세포 배양에 대한 기본 설명에서 AWS구현을 위한 실용적이고 일반적인 프로토콜을 제공하고 지속적인 바이오 프로세싱에서 애플리케이션 잠재력을 더 설명합니다.
분비 치료 단백질을 포함하는 바이오 제조 공정에서 중요한 단계는 수확 된 세포 배양액 (HCCF)에서 바이오 매스를 제거하는 것입니다. 전통적으로, 바이오 제조업체는 단일 클론 항체1의생산에 있는 그들의 1 차적인 해명 방법으로 심층 여과 다음 원심 여과를 채택했습니다. 그러나, 원심 분리는 세포에 높은 전단 응력으로 이끌어 낼 수 있습니다, HCCF에 있는 증가한 세포 파편의 결과로. 이것은 잠재적으로 여과 도중 필터 파울로 이끌어 내고 그 후에 다운스트림 크로마토그래피효율1,2,3을감소시킬 수 있는 추가 오염물질 후 여과귀 귀착될 수 있습니다. 또한 특정 공정에 대한 원심분리기의 사용자 지정비용이 많이 들 수 있으며 확장성을 제한하는 요인이 될 수 있는 클린-인-플레이스 시스템과 살균 시스템에 추가 연결이 필요할 수 있습니다. 깊이 필터를 사용하면 원심 분리의 한계를 보완하고 일회용 기술4를활용할 수 있습니다. 그러나 깊이 필터는 주로 높은 세포 배양 밀도5를견딜 수 없기 때문에 이차 설명으로 사용됩니다. 대안적으로, 접선 유량 여과(TFF) 세포 보존 장치는 전단 응을 완화하기 위해 사용되었지만 막 편광 및 가난한 수확 수율6과같은 어려움을 겪을 수 있다. 원심 분리 및 깊이 여과 또는 TFF의 사용으로 인해 발생하는 위의 문제는 HCCF의 1 차 설명 프로세스를 개선할 수있는 기회를 만듭니다.
음향 분리는 고품질 단백질 제품7,8을사용하여 세포 배양으로부터 분비된 단백질을 수확하는 데 활용할 수 있는 기술로 도입되었다. 음향 분리는 중단된 유체와 상호 작용하는 다차원 서파의 전파 및 반사를 통해 달성되고입자를 유지한 입자 9,10. 이 입자는 유체 드래그, 중력 및 음향 방사선의 세 가지 힘을 경험합니다. 각 힘이 동등하게 서로 반대하여 평형에 도달하면 입자가 일시 중단되어 초음파서파(10)내에 갇혀 있습니다. 세포 배양 현탁액에서, 세포는 서 있는 파의 이 압력 노드 평면 내에서 유지되고, 노드는 세포가 합쳐짐에 따라 증가하고, 결국 이러한 세포 노드 클러스터는 중력력9에서떨어진다. 이러한 퇴적된 세포는 매체에서 제거되어 명확히 된 매체를 펌핑하여 추가 다운스트림 처리를 위해 펌핑할 수 있습니다. 분리 방법으로 초음파의 활용은 지질 입자와적혈구(11)의 분리에서 포유류 관류 세포 배양에 이르는 생물학적 응용 분야로 변환하기시작했다. 원심분리, 깊이 여과 또는 TFF를 피함으로써 비용, 인건비 및 세포 스트레스를 줄이는 상대적인 기능을 갖춘 바이오 제조업체는 음향 분리를 사용하는 잠재적 인 응용 프로그램을 모색하고 있습니다.
이 연구는 CHO 세포 배양을 명확히 하기 위한 벤치탑 음향 파 분리기(AWS)를 운영하기 위한 일반적인 프로토콜을 제공하고, 대표 데이터를 제공하며, 효과적인 세포 설명 및 제품 회수를 달성하는 방법을 보여줍니다.
설명된 것은 CHO 셀라인의 HCCF로부터의 모델 단일클론 항체의 1차 설명에서 벤치 스케일 AWS의 구현을 위한 단계별 프로토콜이다. 대표 결과에 나타난 바와 같이, 1차 설명에서 AWS를 사용하면 효과적인 셀 설명과 제품 복구가 발생했습니다. 또한 낮은 수준의 유지 보수 및 운영 요구 사항 및 확장 기능을 통해 기본 설명에서 더 넓은 응용 프로그램 잠재력을 제공합니다.
중요한 것은, 대표적인 결과는 공급 펌프 속도가 세포의 분리에 중요하다는 것을 건의합니다. 또한, 탁도 측정에서 높은 셀 밀도를 검출하는 데 있어 한계로 인해 작동 셀 밀도는 AWS 시스템을 사용할 때 고려해야 할 또 다른 요소입니다. 탁도 프로브는 높은 세포 밀도 사료 재료를 실행할 때 포화되기 때문에, 공급 재료의 세포 밀도를 측정하고 세포 배양 유체를 오프라인으로 명확히함으로써 세포 분리 효율을 계산하는 것이 가장 좋을 수 있다. 명확한 명확한 정확한 오프라인 측정을 통해 이러한 문제를 해결하는 데 고려될 수 있는 한 가지 공정 전략은 여러 챔버를 연속으로 사용하는 것입니다. 이 프로토콜은 주로 단일 챔버를 사용하는 데 초점을 맞추고 있지만,이 시스템은 세포의 상태에 최소한의 영향을 미치고 높은 제품 회수를 초래할 수있는 세포의 순차적 설명을 위해 세 개의 추가 챔버를 작동 할 수 있습니다. 또한 AWS 및 셀 제거 유량에 대한 전력과 같은 다른 매개 변수는 특정 셀 유형 또는 작동 모드에 더욱 최적화될 수 있습니다. 전반적으로 AWS 구현 전에 이러한 고려 사항을 사용하여 작업 매개 변수 및 전략을 최적화하는 것이 좋습니다.
많은 응용 분야 의 잠재력 중에서도 지속적인 바이오 프로세싱에서 AWS를 사용하는 것이 유망합니다. AWS는 원심분리를 대체하고 필터표면적(14)을대폭 줄일 수 있기 때문에 AWS를 사용하면 연속 적인 바이오 제조와 호환되는 후속 여과 및 크로마토그래피 공정을 위한 셀 프리 재료의 일정한 흐름을 가능하게 합니다. 이러한 호환성 및 고세포 밀도(예: >50 x 106 셀/mL) 및 더 긴 배양 기간(예: >14일)에 대한 관류 기술의 가용성으로 인해 AWS는 1차 설명 외에도 새로운 연속 세포 출혈 전략을 개발할 수 있습니다.
경우에 따라, 생성된 단백질 치료의 최대 30%는 세포 출혈물질(15,16)에서정상 상태 작동 중에 제거된다. 또한, 제거된 단일클론 항체가 표준 수확 물질로 풀링되려면 특정 품질 특성이 충족되어야 한다. 이러한 사양이 충족되지 않으면 제품 수율에 영향을 미칠 수 있는 재료의 거부가 발생할 수 있습니다. 이러한 제품 손실을 보상하기 위해 AWS를 이용한 셀 출혈 물질의 지속적인 설명은 장기 관류프로세스(17)동안 정상 상태로 구현될 수 있다. 이러한 전략은 출혈 물질의 제품 손실을 줄이고 생산된 단백질을 더 많이 활용할 수 있다. 또한 AWS를 이용한 지속적인 설명 후 세포는 더 높은 세포 밀도와 생산성을 위해 원하는 경우 생물 반응기에 다시 추가될 수 있습니다. 따라서 AWS를 사용하여 셀 출혈 재의 지속적인 설명은 주어진 공정에서 수율을 증가시키고/또는 이차 필터 표면적을 감소시킬 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다.
요약하면, AWS의 유틸리티는 간단한 기본 설명에 국한되지 않고 제조 속도와 운영 유연성을 향상시킬 수 있는 지속적인 바이오 프로세싱 응용 분야에 대한 유틸리티가 있을 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 닐루 사라 아덴과 중조가 이 원고에 대한 건설적인 검토를 인정하기를 원합니다. 저자는 또한이 프로젝트 동안 필수적인 입력린지 브라운감사하고 싶습니다. 이 작업에 대한 부분적인 내부 자금 및 지원은 CDER 크리티컬 경로 프로그램 (CA #1-13)과 CDER 제조 과학, 우수 프로그램의 혁신 센터 (Berilla-CoE-19-49)에 의해 제공되었습니다. 이 프로젝트는 미국 에너지 및 FDA 부서 간의 기관 간 계약을 통해 오크 리지 과학 교육 연구소가 관리하는 미국 식품 의약국의 인턴십 /연구 참여 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
이 출판물은 저자의 견해를 반영하며 FDA의 견해 또는 정책을 나타내는 것으로 해석되어서는 안됩니다.
Acoustophorectic chamber | Pall | CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit | |
ActiCHO P | GE | SH31025.01 | powder medium |
AWS | Pall | CAS-SYS (60500101-SP) | |
Cadence Acoustic Separator Software | Pall | Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4 | |
CHO-K1 cells | VRC | VRC01 | |
Computer | Dell | Latitude 3470 | Windows 7, 64 bit OS |
Isopropanol (70%) | LabChem | LC157605 | 20L prepped 70% IPA |
L-glutamine | Corning | 25-005-CV | 200 mM stock solution |
Masterflex L/S 14 tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
Masterflex L/S 16 tubing | Cole-Parmer | 96400-16 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
Tubing set | Pall | CAS-FP-K1 Tubing set | |
Turbidity probe | Pall | CAS-TS-S1 (60500106) |