Summary

Fundición vascular de pulmones de ratón postnatales tempranos y adultos para imágenes micro-CT

Published: June 20, 2020
doi:

Summary

El objetivo de esta técnica es la visualización ex vivo de redes arteriales pulmonares de ratones postnatales y adultos tempranos a través de la inflación pulmonar y la inyección de un compuesto radioopaco a base de polímeros a través de la arteria pulmonar. También se discuten las posibles aplicaciones para los tejidos fundidos.

Abstract

Los vasos sanguíneos forman redes intrincadas en el espacio tridimensional. Por lo tanto, es difícil apreciar visualmente cómo interactúan y se comportan las redes vasculares observando la superficie de un tejido. Este método proporciona un medio para visualizar la compleja arquitectura vascular tridimensional del pulmón.

Para lograr esto, se inserta un catéter en la arteria pulmonar y la vasculatura se enjuaga simultáneamente de sangre y se dilata químicamente para limitar la resistencia. Los pulmones se inflan a través de la tráquea a una presión estándar y el compuesto del polímero se infunde en el lecho vascular a un caudal estándar. Una vez que toda la red arterial se llena y se le permite curar, la vasculatura pulmonar puede visualizarse directamente o ser imagen en un escáner de micro-CT .

Cuando se realiza con éxito, se puede apreciar la red arterial pulmonar en ratones que van desde edades posnatales tempranas hasta adultos. Además, mientras se demuestra en el lecho arterial pulmonar, este método se puede aplicar a cualquier lecho vascular con la colocación optimizada del catéter y puntos finales.

Introduction

El enfoque de esta técnica es la visualización de la arquitectura arterial pulmonar utilizando un compuesto a base de polímeros en ratones. Si bien se ha realizado un trabajo extenso en lechos vasculares sistémicos como el cerebro, el corazón y los riñones1,2,3,4,5, se dispone de menos información sobre la preparación y llenado de la red arterial pulmonar. El objetivo de este estudio, por lo tanto, es ampliar el trabajo anterior6,7,8 y proporcionar una referencia detallada escrita y visual que los investigadores pueden seguir fácilmente para producir imágenes de alta resolución del árbol arterial pulmonar.

Si bien existen numerosos métodos para etiquetar y tomar imágenes de vasculatura pulmonar, como la resonancia magnética, la ecocardiografía o la angiografía por TC9,10, muchas de estas modalidades no logran llenar y/o capturar adecuadamente los vasos pequeños, lo que limita el alcance de lo que se puede estudiar. Métodos tales como sección en serie y reconstrucción proporcionan alta resolución, pero son intensivos en tiempo/trabajo11,12,13. La integridad de los tejidos blandos circundantes se ve comprometida en la fundición de corrosión tradicional10,13,14,15,16. Incluso la edad y el tamaño de los animales se convierten en factores al intentar introducir un catéter o, la resolución es deficiente. La técnica de inyección de polímero, por otro lado, llena las arterias al nivel capilar y cuando se combina con el TCT, permite una resolución sin igual5. Las muestras de los pulmones de ratón tan jóvenes como el día 14 postnatal se han echado con éxito8 y se han procesado en cuestión de horas. Estos pueden ser reencaneados indefinidamente, o incluso enviados para preparación histológica / microscopía electrónica (EM) sin comprometer el tejido blando existente17. Las principales limitaciones de este método son el costo inicial de los equipos/software de TC, los desafíos con el monitoreo preciso de la presión intravascular y la incapacidad de adquirir datos longitudinalmente en el mismo animal.

Este documento se basa en el trabajo existente para optimizar aún más la técnica de inyección de la arteria pulmonar y empujar los límites relacionados con la edad/tamaño hasta el día posnatal 1 (P1) para producir resultados sorprendentes. Es más útil para los equipos que quieren estudiar redes vasculares arteriales. En consecuencia, proporcionamos nuevas directrices para la colocación/estabilización del catéter, un mayor control sobre la tasa de llenado/volumen y destacamos los notables escollos para un mayor éxito de fundición. Los moldes resultantes se pueden utilizar para futuras caracterizaciones y análisis morfológicos. Tal vez lo más importante, esta es la primera demostración visual, a nuestro conocimiento, que guía al usuario a través de este intrincado procedimiento.

Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (ACUC) del Instituto Nacional de Pulmón Cardíaco y Sangre. 1. Preparación Inyecte el ratón por vía intraperitoneal con heparina (1 unidad/g de peso corporal del ratón) y permita que se ambula durante 2 min. Eutanasia al animal en una cámara deCO2. Coloque el ratón en una posición supina en una placa quirúrgica y asegure las cuatro extremi…

Representative Results

Un molde exitoso exhibirá un llenado uniforme de toda la red arterial pulmonar. Lo demostramos en ratones C57Bl/6J que varían en edad: día posnatal P90 (Figura 4A), P30 (Figura 4B), P7 (Figura 4C) y P1 (Figura 4D). Mediante el control de la velocidad de flujo y la supervisión visual del relleno en tiempo real, se lograron puntos finales fiables de la vasculatura más…

Discussion

Ejecutado correctamente, este método produce imágenes impactantes de redes arteriales pulmonares, lo que permite la comparación y experimentación en modelos de roedores. Varios pasos críticos en el camino aseguran el éxito. En primer lugar, los investigadores deben heparinizar al animal en la etapa preparatoria para evitar que se formen coágulos de sangre en la vasculatura pulmonar y las cámaras del corazón. Esto permite el tránsito arterial completo del compuesto de polímero. En segundo lugar, al perforar el …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue apoyada en parte por el Programa de Investigación Intramuros NHLBI (DIR HL-006247). Nos gustaría dar las gracias a NIH Mouse Imaging Facility por orientación en la adquisición y análisis de imágenes.

Materials

1cc syringe Becton Dickinson 309659
20ml Glass Scintillation Vials Fisher 03-340-25P
30G Needle Becton Dickinson 305106
50mL conical tubes Cornin 352098 For sample Storage and scanning
60cc syringe Becton Dickinson 309653
7-0 silk suture Teleflex 103-S
Analyze 12.0 Software AnalyzeDirect Inc. N/A Primary Software
Amira 6.7 Software Thermo Scientific N/A Alternative Sofware
CeramaCut Scissors 9cm Fine Science tools 14958-09
Ceramic Coated Curved Forceps Fine Science tools 11272-50
CO2 Tank Robert's Oxygen Co. n/a
Dual syringe pump Cole Parmer EW-74900-10
Dumont Mini-Forceps Fine Science tools 11200-14
Ethanol Pharmco 111000200
Formalin Sigma – Life Sciences HT501128
Gauze Covidien 441215
Hemostat Fine Science tools 13013-14
Heparin (1000USP Units/ml) Hospira NDC 0409-2720-01
Horos Software Horos Project N/A Alternative Sofware
induction chamber n/a n/a
Kimwipe Fisher 06-666 fiber optic cleaning wipe
Labelling Tape Fisher 15966
Magnetic Base Kanetec N/A
Micro-CT system SkyScan  1172
Microfil (Polymer Compound) Flowech Inc. Kit B – MV-122 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent
Micromanipulator Stoelting 56131
Monoject 1/2 ml Insulin Syringe Covidien 1188528012
Octagon Forceps Straight Teeth Fine Science tools 11042-08
Parafilm Bemis company, Inc. #PM999
PE-10 tubing Instech BTPE-10
Phospahte buffered Saline BioRad #161-0780
Ring Stand Fisher S13747 Height 24in.
Sodium Nitroprusside sigma 71778-25G
Steel Plate N/A N/A 16 x 16 in. area, 1/16 in thick
Straight Spring Scissors Fine Science tools 15000-08
SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter Santa Cruz Biotechnology 360103
Surgical Board Fisher 12-587-20 This is a converted slide holder
Universal 3-prong clamp Fisher S24280
Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing Nipro PR25G19
Zeiss Stemi-508 Dissection Scope Zeiss n/a

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Cite This Article
Knutsen, R. H., Gober, L. M., Sukinik, J. R., Donahue, D. R., Kronquist, E. K., Levin, M. D., McLean, S. E., Kozel, B. A. Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging. J. Vis. Exp. (160), e61242, doi:10.3791/61242 (2020).

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