区分肺内免疫细胞与血管内免疫细胞群体：颈静脉内途径

摘要

本研究的目的是描述一种在肺部炎症研究中区分血管内与实质内免疫细胞的实验方案。我们在收获肺组织之前，通过颈静脉注射荧光标记的抗体。此外，我们采用基于膨胀的肺组织消化方法，以提高肺部白细胞的回收率。

摘要

昼夜节律是指以约24小时为周期发生的各种生物过程的振荡。在分子水平上，这种节律由核心时钟基因构成的转录-翻译反馈环路（TTFL）网络所驱动。各个组织和器官系统（包括免疫系统）均拥有自身的生物钟。在体循环中，CD45⁺ 细胞群体中的多个成员在一天中呈现节律性波动；然而，在组织驻留的CD45⁺ 白细胞群体中，许多此类节律并不相同甚至不相似。在研究昼夜节律对肺部炎症调控作用时，可能需要专门分析肺内的CD45⁺ 细胞。然而，尽管已优化灌注方法，仍会有部分循环中滞留的白细胞残留在肺组织中。本实验方案的设计目标是区分血管内与肺实质内的白细胞。为此，在收获肺组织前，通过颈静脉注射荧光标记的CD45抗体至小鼠体内。随后采用定制的肺组织消化技术对肺组织进行消化，以获得单细胞悬液。样本使用针对肺实质免疫细胞的标准抗体组合（包括另一种CD45抗体）进行染色。流式细胞术分析可清晰地区分不同细胞群体。因此，当肺内免疫细胞与循环免疫细胞在数量和功能上存在显著差异时，该标记和定义肺内CD45⁺ 细胞的方法将尤为重要。

引言

本文介绍了区分血管内白细胞与肺部白细胞的高效且可靠的方法。即使采用最佳的灌注技术，研究仍发现循环中的CD45⁺细胞在肺组织中存在残留。这会削弱区分循环系统与肺组织中细胞节律的能力，而在肺部炎症情况下，这一问题尤为突出。这对于研究炎症的昼夜节律调控具有重要意义。

昼夜节律是指各种生物过程以24小时为周期发生的日间振荡。该节律系统是一种在进化上保守的预测性机制，当机体面临环境变化（如感染威胁）时，可为宿主提供保护作用。在细胞水平上，生物钟由核心钟基因构成的自我维持的转录-翻译反馈环路所组织¹。免疫系统拥有自身的生物钟，影响其对病原体和炎症损伤的应答^2,3。由于肺是持续暴露于外界环境的器官，昼夜节律在肺中尤为重要⁴。肺内的多种免疫过程均受到生物钟的调控^5,6,7。然而，肺部与全身循环中各种生物过程的相位并不相同⁸，这意味着白细胞在肺组织与循环系统中的振荡模式也可能存在差异。因此，在昼夜节律研究背景下，建立一种能够有效区....

方案

所有动物实验均经宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合《实验动物护理和使用指南》的规定。

注意：整个过程可分为 1）静脉内 CD45 标记，2）收获，3）消化，以及 4）染色与流式细胞术。这些步骤已在图 1中总结。

1. 溶液/试剂的配制

1. 通过向500 mL DMEM中加入5 mL 2 mM L-谷氨酰胺、20 mL 胎牛血清（FBS）、1 mL 2-巯基乙醇和10 mL 青霉素-链霉素溶液，制备解离培养基。
   注意：解离培养基在2-4 °C保存时可稳定保存长达2个月。
2. 通过向500 mL 不含镁和钙的PBS中加入10 mL FBS和500 mg叠氮化钠，制备荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液。
   注意：加入叠氮化钠后，FACS缓冲液可在2-4 °C下保存数月。
3. 在样本采集当天，将DNase和Liberase溶液以1:100的比例稀释加入解离培养基中（即每1 mL解离培养基中加入10 µL DNase和Liberase）。
   注意：每只小鼠全肺消化需10 mL/只，半肺消化需5 mL/只。

2. 静脉内 CD45 标记

1. 本实验使用8至12周龄的成年C57Bl6....

结果

采用该技术，未处理的解离肺组织总细胞数（代表性数据仅使用左肺叶）在 27.3 × 10⁶ 至 71.1 × 10⁶ 个细胞/mL 之间。在根据细胞大小设门并排除双联体和死细胞后（设门策略见图2），白细胞计数范围为 6.9 × 10⁶ 至 13.5 × 10⁶ 个细胞/mL。即使经过灌注清除肺部，仍滞留在其中的循环白细胞约占实验中活细胞的 4% 至 13%。解离肺组织中的所有白细胞均在 PE-Cy7 荧光通道中对 CD45 染色阳性，但只有循环白细胞在两种荧光染料（PE-Cy7 和 Pac Blue）标记的 CD45 抗体中均呈双染。尽管已标准化灌注流程，我们发现解离肺组织中约有 24% 至 70% 的总白细胞属于循环白细胞群体。未校正血管内标记时的平均白细胞计数为 10.2 × 10⁶ 个细胞/mL，而校正后的数值为 4.93 × 10⁶ 个细胞/mL（图3A）。因此，若未能区分灌注后仍残.......

讨论

对肺部炎症和肺免疫应答进行细致研究，对于理解多种疾病状态至关重要。流式细胞术常规用于计数肺部白细胞并确定其功能意义。白细胞的功能至少部分取决于其所在位置。尽管已有越来越多的证据表明，即使采用完美的灌注方案，肺部仍会残留大量血管内白细胞，但大多数研究并未区分肺实质内与血管内的白细胞。此外，灌注后残留在肺部的血管内白细胞可能因样本制备方式不同而在各样本中随机分布，因此无法预测其对实验结果的影响。这限制了研究结果的普适性，也对涉及流式细胞术的研究之严谨性和可重复性构成威胁¹²。

本文介绍了一种用于区分血管内残留白细胞与真正肺实质内白细胞的方法。尽管此类方法此前已有应用^9,13,14，但我们优化了标记及组织消化步骤，使该制备方法达到最高效率。其他研究曾描述采用眶后静脉或尾静脉注射进行血管内标记¹⁰。眶后注射对动.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
博克尔科学中等水浴锅	博克尔科学基金	290200
10 mL BD 注射器，带 BD Luer-Lok 接头	BD 生物科学	309604
5 mL BD 注射器，带 BD Luer-Lok 接头	BD 生物科学	309646
抗-CD45-Pac Blue	Biolegend	103114
抗CD45-PE/Cy7	Biolegend	103114
细胞滤网 70 µm 尼龙	Fisher	352350
康宁50 mL圆锥底离心管	Avantor	21008-714
康宁Falcon带细胞过滤帽的离心管	EMSCO	10004637
解剖显微镜	Olympus	SZX-SDO2
DMEM，高糖	Life Technologies	11965084
Dnase	罗氏	10104159001
不含 Ca 的 DPBS++ && Mg++		14190136
Fc阻断	Biolegend	101320
HyClone 胎牛血清	GE Healthcare	SH30071.03
L-谷氨酰胺（200 mM）	Life Technologies	25030-081
Liberase 研究级	Sigma	5401127001
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Life Technologies	15140-122
精密振荡水浴箱	赛默飞世尔科技	TSSWB15
红细胞裂解缓冲液	Sigma	R7757
4-0 丝线缝合线	Roboz	SUT-15-2