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Biochemistry

Analyse unicellulaire d’allèles transcriptionnellement actifs par molécule unique FISH

Published: September 20, 2020 doi: 10.3791/61680
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology, Baylor College of Medicine

Summary

L’hybridation in situ par fluorescence d’ARN à molécule unique (smFISH) est une méthode permettant de quantifier avec précision les niveaux et la localisation d’ARN spécifiques au niveau de la cellule unique. Ici, nous rapportons nos protocoles de laboratoire validés pour le traitement au banc humide, l’imagerie et l’analyse d’images pour la quantification unicellulaire d’ARN spécifiques.

Abstract

La transcription des gènes est un processus essentiel en biologie cellulaire et permet aux cellules d’interpréter et de répondre aux signaux internes et externes. Les méthodes traditionnelles de population en vrac (Transfert de Northern, PCR et ARSEq) qui mesurent les niveaux d’ARNm n’ont pas la capacité de fournir des informations sur la variation des réponses d’une cellule à l’autre. Une visualisation et une quantification précises d’une seule cellule et d’une seule cellule sont possibles grâce à l’hybridation in situ par fluorescence d’ARN à molécule unique (smFISH). ARN-FISH est réalisé en hybridant des ARN cibles avec des sondes oligonucléotidiques étiquetées. Ceux-ci peuvent être imagés dans des modalités de débit moyen / élevé et, grâce à des pipelines d’analyse d’images, fournir des données quantitatives sur les ARN matures et naissants, le tout au niveau de la cellule unique. Les étapes de fixation, de perméabilisation, d’hybridation et d’imagerie ont été optimisées en laboratoire pendant de nombreuses années à l’aide du système de modèle décrit ici, ce qui se traduit par une analyse unicellulaire réussie et robuste de l’étiquetage smFISH. L’objectif principal de la préparation et du traitement des échantillons est de produire des images de haute qualité caractérisées par un rapport signal/bruit élevé afin de réduire les faux positifs et de fournir des données plus précises. Ici, nous présentons un protocole décrivant le pipeline de la préparation des échantillons à l’analyse des données en conjonction avec des suggestions et des étapes d’optimisation à adapter à des échantillons spécifiques.

Introduction

La transcription et la traduction des gènes sont les deux processus majeurs impliqués dans le dogme central de la biologie, allant de la séquence d’ADN à l’ARN en passant par la protéine1. Dans cette étude, nous nous concentrons sur la production d’ARN messager (ARNm) pendant la transcription. La molécule d’ARN naissante comprend à la fois des introns non codants et des exons codants. Les introns sont épissés co-transcriptionnellement avant que l’ARNm ne se déplace dans le cytoplasme pour être traduit sur les ribosomes2,3.

Traditionnellement, la mesure de l’ARNm est effectuée dans des populations de cellules en vrac (des centaines à des millions) avec des tests classiques tels que la RT-qPCR ou le Northern blotting. Bien que très puissantes, ces méthodes sont limitées car elles ne fournissent pas d’informations sur la variation de cellule à cellule (hétérogénéité phénotypique), l’identification du nombre d’allèles transcriptionnellement actifs et, peut-être plus important encore, manquent d’informations spatiales. Plus récemment, les technologies à l’échelle du génome permettant le séquençage de l’ARN unicellulaire (RNAseq) ont commencé à combler le fossé entre les méthodes d’imagerie et le séquençage4. Cependant, RNAseq souffre d’une efficacité de détection relativement faible et les étapes de traitement entraînent une perte complète d’informationsspatiales 5. Bien que l’ARNAseq unicellulaire puisse fournir des informations sur l’hétérogénéité phénotypique au sein d’une population de cellules isogéniques, l’hybridation in situ par fluorescence d’ARN (ARN-FISH) peut faciliter une exploration plus complète de l’expression des gènes cibles au niveau spatial, et sur une base allèle par allèle6,7.

RNA FISH est une technique qui permet la détection et la localisation de molécules d’ARN cibles dans des cellules fixes. Contrairement aux méthodes laborieuses antérieures, RNA-FISH, actuellement à la pointe de la technologie, utilise des sondes d’acide nucléique disponibles dans le commerce qui sont complémentaires aux séquences d’ARN cibles, et ces sondes s’hybrident à leurs cibles par appariement de base Watson-Crick8. Les premières techniques d’hybridation in situ impliquaient un protocole similaire établi par Gall et Pardue en 1969, car un échantillon était traité avec des sondes d’acide nucléique qui s’hybridaient spécifiquement en un ARN cible9. À l’origine, le test était effectué à l’aide d’une détection radioactive ou colorimétrique; cependant, dans les années 1980, le développement de protocoles d’hybridation in situ par fluorescence (FISH) à l’ADN FISH et plus tard à l’ARN FISH a ouvert la voie à une détection plus sensible et au potentiel de multiplexage10,11.

D’autres développements dans l’ARN FISH ont conduit à la capacité de détecter et de quantifier des molécules d’ARN uniques (smFISH)12,13. La détection directe est une méthode dans laquelle les sondes elles-mêmes sont étiquetées avec des fluorophores. Un défi avec smFISH est qu’il est nécessaire d’avoir suffisamment de sondes / cibles hybridantes pour faciliter la détection des signaux fluorescents en tant que points distincts et limités par diffraction. Pour résoudre ce problème, on peut utiliser un ensemble de sondes d’oligonucléotides d’ADN simple brin courts complémentaires à diverses régions de l’ARN cible8,12,14. La liaison de plusieurs sondes augmente la densité locale des fluorophores, rendant l’ARN visible comme un point distinct de haute intensité par microscopie à fluorescence. Cette méthode est avantageuse car la liaison hors cible des oligonucléotides dans le pool d’ensembles de sondes peut être distinguée du signal spot d’ARN véritable en analysant quantitativement la taille et l’intensité des points pour différencier le signal réel et la liaison fausse aux oligonucléotides, facilitant ainsi une analyse plus précise en réduisant les faux positifs12.

Les méthodes alternatives pour détecter l’ARNm sont la méthode classique de traduction des entailles basée sur le clone BAC et le système d’ADN ramifié plus récemment développé. Dans la méthode de traduction par entaille clonée au BAC, l’ADN à étiqueter est entaillé enzymatiquement et un nouveau nucléotide est ajouté à l’extrémité 3' exposée. L’activité de l’ADN polymérase I ajoute un nucléotide marqué résultant en la sonde souhaitée15,16. La technique de l’ADN ramifié implique des sondes d’oligonucléotides qui s’hybrident par paires avec des cibles d’ARN et ces sondes sont amplifiées à l’aide de plusieurs molécules d’amplification du signal. Cette méthode peut améliorer considérablement le rapport signal/bruit, mais l’amplification peut fausser la quantification précise puisque les taches fluorescentes peuvent être très différentes en taille et en intensité17.

En tant que système modèle pour ce protocole, qui est pleinement utilisé dans le cadre de la participation au programme de recherche NIEHS Superfund pour quantifier les effets des perturbateurs endocriniens dans Galveston Bay / Houston Ship Channel, nous avons utilisé la lignée cellulaire MCF-7 du cancer du sein MCF-7 positive au récepteur des œstrogènes (ER) traitée pendant la nuit avec un agoniste ER, le 17β-estradiol (E2)7,18,19. E2 régule de nombreux gènes cibles ER, y compris le gène prototype ER-cible, GREB17,20,21,22. Le protocole smFISH décrit ici utilise un ensemble de deux ensembles de sondes séparés spectralement ciblant GREB1; l’un qui s’hybride en exons et l’autre en introns, permettant la mesure de l’ARN7mature et naissant. Nous utilisons ensuite la microscopie à épifluorescence couplée à la déconvolution pour imager des échantillons marqués smFISH, puis appliquons des routines d’analyse d’images pour quantifier le nombre d’allèles actifs et d’ARN matures par cellule.

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Protocol

Pour assurer des résultats optimaux, la partie de laboratoire humide de ce protocole nécessite des précautions standard sans RNase à toutes les étapes. Par exemple, l’utilisation d’embouts de pipette filtrés, de récipients stériles et de tampons sans RNase est fortement encouragée. L’utilisation d’inhibiteurs de la RNase tels que les complexes ribonucléosides de vanadyle est également suggérée, en particulier pour les ARN cibles à faible abondance.

1. Culture cellulaire et configuration expérimentale

  1. Maintenir les cellules adhérentes du cancer du sein MCF-7 (ATCC #HTB-22) dans une fiole de culture tissulaire T75 avec du rouge phénol sans phénol (uniquement nécessaire pour les expériences de stimulation hormonale) Le milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, 1 nM de pyruvate de sodium, 50 UI / mL de pénicilline et 50 μg / mL de streptomycine.
  2. Placer des couvercles ronds enduits de poly-D-lysine gravés à l’acide (0,16 à 0,19 mm d’épaisseur, 12 mm de diamètre) dans une plaque de culture tissulaire multipuits de 24 puits.
    REMARQUE: Utiliser 1 M HCl pour graver à l’acide les couvercles et enduire avec une solution de 1 mg / mL de poly-D-lysine reconstituée dans du PBS stérile (solution saline tamponnée au phosphate sans Ca++ et Mg++) selon les protocoles standard.
  3. Retirer le milieu de croissance des cellules et laver une fois avec 5 mL de PBS stérile (solution saline tamponnée au phosphate sans Ca++ et Mg++). Détacher les cellules MCF-7 à l’aide de 2 à 3 mL de solution de trypsine-EDTA à 0,25 %. Une fois les cellules détachées, neutraliser la solution de trypsine-EDTA à 0,25% avec un volume égal de milieu de croissance.
  4. Transférer les cellules dans la suspension du milieu dans un tube conique de 15 mL, tourner vers le bas à 391 x g pendant 1 minute pour granuler les cellules. Retirez soigneusement le support du tube conique sans perturber la pastille cellulaire et ressuspendez les cellules dans une quantité appropriée de milieu de traitement.
    REMARQUE: Le milieu de traitement est le DMEM sans phénol-rouge complété par 5% de FBS dépouillé et dialysé au charbon de bois-dextran, 2 mM de L-glutamine, 1 nM de pyruvate de sodium, 50 UI / mL de pénicilline et 50 μg / mL de streptomycine. Ce milieu est essentiel pour les expériences de stimulation hormonale stéroïdienne car le composant sérique est largement appauvri en stéroïdes par le charbon de bois décapant le milieu, et a réduit les facteurs de croissance par dialyse.
  5. Ensemencez les cellules sur des couvercles dans la plaque de 24 puits multiples à 60 000 à 70 000 cellules par puits dans 500 μL de milieux de traitement. Pour cette expérience, la confluence cellulaire devrait être d’environ 70 à 80% au début du traitement. Optimisez la densité d’ensemencement des cellules en fonction du type de cellule, du taux de croissance et de la durée de l’expérience pour éviter la confluence, ce qui complique l’analyse d’image.
    REMARQUE: Pour une meilleure imagerie et analyse d’image, évitez l’agglutination des cellules. À cette fin, mélangez soigneusement l’aliquote des cellules en pipetant (ou en vortexant brièvement) les cellules plusieurs fois avant de les distribuer dans les puits. Avant de replacer les cellules plaquées dans l’incubateur, laisser les cellules s’installer dans la hotte de culture tissulaire pendant environ 20 minutes aide à réduire l’agglutination cellulaire.
  6. Incuber les cellules pendant au moins deux jours avant les traitements pour assurer la synchronisation du cycle cellulaire et la réduction de fond due à toute molécule de signalisation qui reste dans le sérum dépouillé / dialysé du milieu de croissance.
  7. Après une incubation de 48 heures dans des milieux de traitement, traiter les cellules MCF-7 avec 10 nM 17β-estradiol (E2) et le contrôle du véhicule (DMSO), diluées dans des milieux de traitement pendant 24 heures. Ce traitement utilise une dose saturante d’E2 pour induire une réponse maximale. Effectuer des expériences de traitement temporel et de dose-réponse pour déterminer empiriquement les conditions de différents gènes cibles, modèles cellulaires et types de traitements. À titre d’exemple, voir notre récente publication7.

2. Préparation des tampons

  1. Pour préparer le tampon de fixation, diluer le formaldéhyde monomère purifié (vendu par les fournisseurs de microscopie électronique sous le nom de paraformaldéhyde à 16 %) à 4 % dans du PBS stérile Ca++/ Mg++ (solution saline tamponnée au phosphate plus Ca++ et Mg++). Ajouter les complexes de ribonucléosides de vanadyle (VRC) au tampon de fixation pour une concentration finale de 2 mM afin de retarder la dégradation de l’ARN.
    1. Calculez la quantité totale de tampon de fixation en fonction de la nécessité de 300 à 500 μL de fixateur par puits d’une plaque de 24 puits multiples. Conservez le formaldéhyde à 4 % sur de la glace jusqu’à ce que l’étape de fixation soit nécessaire.
      REMARQUE: Rendez le tampon de fixation frais pour chaque expérience.
      ATTENTION : Le formaldéhyde est un tératogène qui est absorbé par la peau. Utilisez ce produit chimique dans une hotte avec un EPI approprié conformément à vos réglementations institutionnelles.
  2. Pour l’étape de perméabilisation, préparez de l’éthanol à 70% dans de l’eau sans nucléase. Une autre option est 0,5% Triton-X100 dans PBS stérile Ca++/ Mg++ plus 2 mM de VRC. Calculer la quantité totale de tampon de perméabilisation nécessaire en utilisant 500 μL de tampon par puits.
  3. Pour préparer 9 mL du tampon d’hybridation, ajouter 2 mL de stock de sulfate de dextran à 50 % et 1 mL de tampon SSC (citrate de sodium salin) à 6 mL d’eau libre de nucléase. Vortex pour bien mélanger le tampon d’hybridation. Ce tampon peut être conservé à 4 °C jusqu’à une semaine.
  4. Il y a cinq étapes de lavage distinctes qui nécessitent 2x tampon de citrate de sodium salin (SSC). Calculez le volume final de 2x tampon SSC nécessaire en anticipant 500 μL de tampon par couvercle par étape de lavage. Diluer la quantité requise de stock 20x tampon SSC dans de l’eau sans nucléase. 2 mM VRC peuvent être ajoutés aux étapes de lavage par mesure de précaution supplémentaire. Ce tampon peut être stocké à température ambiante pendant toute la durée des étapes de traitement.

3. Fixation de l’ARN FISH

  1. Après le traitement, retirer le milieu des puits et laver une fois avec du PBS Ca++/ Mg++stérile et froid . Si un modèle de cellule à faible adhérence est utilisé, n’utilisez pas de vide pour aspirer le liquide; utilisez le pipetage manuel pour retirer soigneusement le média du côté du puits et omettre l’étape de lavage initiale. Ajouter un tampon de fixation de 500 μL pendant 30 minutes sur la glace.
    REMARQUE: Si l’échantillon est sujet à la dégradation de l’ARN, utilisez un PBS stérile avec 2 mM VRC pour l’étape de lavage à ce stade.
  2. Enlevez le fixateur et éliminez-le dans les déchets chimiques conformément à la réglementation institutionnelle. Lavez les cellules deux fois avec du PBS Ca++/ Mg++ stérile à froid pendant 3 minutes.
  3. Retirer le PBS et ajouter 500 μL d’éthanol à 70 % à chaque puits. Scellez la plaque de 24 puits avec un film plastique de paraffine. Placer sur un rotateur à 4 °C pendant au moins quatre heures. Il est préférable de laisser les échantillons dans de l’éthanol à 70% pendant la nuit. Le protocole peut être mis en pause à ce stade et les échantillons peuvent être stockés jusqu’à une semaine dans de l’éthanol à 70%.
    REMARQUE: Un Triton-X100 à 0,5% dans PBS avec une solution VRC de 2 mM peut être utilisé comme alternative. Incuber les échantillons dans 500 μL de ce tampon de perméabilisation pendant 20 minutes à température ambiante sur un rotateur. Si vous utilisez ce tampon de perméabilisation, le protocole ne peut pas être suspendu à ce stade et doit continuer à travers l’étape d’hybridation.

4. Hybridation pour ARN FISH

  1. Retirez le tampon de perméabilisation et lavez une fois dans 500 μL de 2x tampon SSC plus 10% de formamide pendant 5 minutes à température ambiante sur un rotateur.
  2. Préparez la mémoire tampon d’hybridation complète. Calculer environ 30 μL de tampon d’hybridation complet par couvercle. Ajoutez du formamide au tampon d’hybridation pour atteindre le pourcentage nécessaire. Par exemple, si 500 μL de tampon d’hybridation complet sont nécessaires, il serait alors constitué de 450 μL du tampon d’hybridation précédemment fabriqué plus 50 μL de formamide de qualité moléculaire pour atteindre 10% vol/vol. Vortex brièvement à mélanger.
    ATTENTION: Le formamide est un tératogène qui est absorbé par la peau. Utilisez ce produit chimique dans une hotte avec un EPI approprié conformément à la réglementation institutionnelle.
  3. Diluer les sondes d’intron GREB1 (marqué avec Atto 647N) et d’exon GREB1 (marqué avec Quasar 570) 1:300 dans un tampon d’hybridation. Mélanger par pipetage. Protégez ce tampon de la lumière et utilisez-le immédiatement.
    REMARQUE: Les sondes ont été conçues et fabriquées comme détaillé dans Stossi et al7. Les sondes sont généralement fournies sous la forme d’un pool de sondes oligonucléotidiques séchées qui doivent être reconstituées dans un tampon TE sans ARNi conformément au protocole du fabricant14. La solution mère pour ces sondes était donc de 12,5 μM; la concentration de travail des sondes est de 42 nM.
  4. Préparez une chambre d’humidification pour l’étape d’hybridation de nuit. Déposer un morceau de film plastique de paraffine, côté non exposé vers le haut, dans une boîte de Petri en verre nettoyée avec un décontaminant de surface pour éliminer les RNases. Saturez deux serviettes en papier avec de l’eau stérile et placez-les le long des bords de la boîte de Pétri pour fournir de l’humidité, car le séchage peut détruire un étiquetage spécifique.
  5. Aliquotez les sondes en parsemant 30 μL de sondes dans un tampon d’hybridation sur le côté propre du film plastique de paraffine. Répartissez les aliquotes des sondes afin que les couvercles n’entrent pas en contact les uns avec les autres.
  6. À l’aide de pinces stérilisées, retournez doucement le côté de la cellule des couvercles vers le bas sur les sondes dans la boîte de Petri en verre. Évitez les bulles d’air et n’appliquez pas de pression sur les couvercles.
    REMARQUE: Ne jetez pas la plaque de culture tissulaire avec le tampon SSC 2x, car il sera nécessaire pour les étapes suivantes.
  7. Scellez la boîte de Petri en verre avec un film plastique de paraffine et recouvrez la plaque de papier d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière des fluorophores. Incuber pendant la nuit, jusqu’à 16 heures, à 37 °C sur une surface plane non rotative. Le temps d’incubation peut varier empiriquement, mais un minimum de 4 heures est recommandé.
    REMARQUE: Les couvercles sont susceptibles de glisser lors de l’incubation dans le tampon d’hybridation, ce qui peut entraîner des taches sèches sur le couvercle et endommager l’échantillon.

5. Préparation des échantillons pour l’imagerie

  1. Le lendemain, retirez les couvercles de la chambre d’humidification à l’aide d’une pince et retournez-les dans la plaque de 24 puits avec le côté cellulaire vers le haut. Ajouter 500 μL de tampon frais 2x SSC plus 10% de formamide pour éliminer l’excès de sonde et l’hybridation non spécifique.
    REMARQUE: Protégez les échantillons de la lumière à partir de ce point.
  2. Lavez les cellules deux fois avec 500 μL de tampon SSC 2x plus 10% de formamide pendant 15 minutes chacune à 37 °C sur un rotateur chauffé.
  3. Contre-tache l’ADN avec DAPI à 1 μg/mL dans 2x tampon SSC pendant 10 minutes à température ambiante sur un rotateur.
  4. Lavez une fois avec 2x tampon SSC pendant 5 minutes à température ambiante.
  5. Montez les couvercles sur des lames de verre à l’aide d’un support de montage non durcissant après avoir retiré tout excès de tampon SSC 2x avec une serviette en papier et un lavage rapide à l’eau sans nucléase pour éliminer l’excès de sels. Enfin, scellez les couvercles avec du vernis à ongles transparent.

6. Microscopie haute résolution et traitement d’image

  1. Imagez les échantillons sur un microscope à épifluorescence à grand champ à l’aide d’un objectif d’huile 60x ou 100x et d’une caméra sCMOS. Voir le tableau des matériaux pour le microscope spécifique et l’objectif utilisé pour cette expérience.
    1. Complétez l’imagerie dès que les échantillons sont entièrement traités pour éviter la dégradation du signal en fonction du temps.
      REMARQUE: L’huile d’immersion avec un indice de réfraction (RI) de 1,516 est utilisée dans cette expérience. Des tests empiriques doivent être effectués pour faire correspondre l’IR de l’huile à des échantillons spécifiques, car les incohérences de l’IR entraîneront des aberrations de la fonction d’étalement ponctuel qui affecteront la déconvolution de l’image.
  2. Les images sont capturées avec une taille de pixel latérale de 0,10827 μm.
  3. Optimisez la quantité d’éclairage de la source lumineuse (c.-à-d. le pourcentage de transmittance) et les temps d’exposition pour chaque canal (filtres DAPI, TRITC, CY5 dans cet exemple particulier) en utilisant l’échantillon qui devrait avoir l’intensité la plus élevée (c.-à-d. les témoins positifs). Dans cette expérience, l’échantillon traité À l’E2 devrait avoir une intensité plus élevée pour les deux ensembles de sondes GREB1. En règle générale, le pourcentage de transmittance pour les sondes intron et exon GREB1 est de 50 à 100%, et les temps d’exposition varient de 0,25 à 0,60 seconde.
  4. De plus, acquérez des images dans des conditions qui évitent le photobleaching et/ou toute saturation des pixels de l’appareil photo. D’après notre expérience, il devrait y avoir une différence minimale d’environ dix fois entre l’arrière-plan et l’intensité du signal. Une saturation de quelques pixels/champ peut se produire en raison de signaux non spécifiques dans l’échantillon (c.-à-d. saleté sur le couvercle, agrégats de sonde à l’extérieur de la cellule), ce qui peut être acceptable, mais seulement si les régions saturées ne sont pas incluses dans la quantification.
  5. Pour définir l’acquisition d’une pile z, concentrez-vous sur l’échantillon dans le canal DAPI. Sélectionnez le haut et le bas de la pile z aux distances où les noyaux colorés DAPI deviennent flous. La taille de l’étape z-stack que nous avons utilisée est de 0,25 μm par tranche et la z-stack totale devrait couvrir toute la cellule (environ 10 μm dans les cellules MCF-7). Cependant, la taille de l’étape z-stack changera en fonction de l’objectif utilisé et devrait suivre le critère d’échantillonnage de Nyquist.
    REMARQUE: Les introns ne sont généralement présents que dans le noyau; cependant, les exons sont à la fois dans le noyau et le cytoplasme. Par conséquent, le réglage de la pile z comme décrit ci-dessus capturera la majeure partie de l’étiquetage de l’intron et de l’exon, car la pile z englobe la cellule entière.
  6. En règle générale, imagez un minimum de 200 cellules pour une analyse quantitative dans des expériences préliminaires afin de capturer un instantané de l’ampleur de la réponse et de la variation entre les cellules.
  7. Certaines cellules imagées sont exclues de l’analyse finale (c.-à-d. le taux d’abandon) parce qu’elles seront filtrées par le pipeline d’analyse (c.-à-d. les cellules touchant la bordure de l’image, les cellules apoptotiques/mitotiques).
    REMARQUE: Lors de la sélection des zones d’image, il y a quelques facteurs à garder à l’esprit. Choisissez des zones avec des cellules uniformément réparties et sans chevauchement, telles que définies par la fluorescence nucléaire marquée DAPI. En outre, essayez de sélectionner les zones qui ont le moins de noyaux le long des bords de la zone de l’image pour éviter de compter les cellules partielles. L’imagerie automatisée et impartiale est toujours préférée pour les expériences nécessitant une analyse statistique.
  8. Après l’acquisition, déconvolez les images à l’aide d’un algorithme de restauration agressif à l’aide de 10 cycles (c.-à-d. nombre d’itérations). Générez des projections d’intensité maximale pour l’analyse d’images (omettez cette étape si une analyse 3D spécifique est requise). Enregistrez toutes les images de projection en fonction de la profondeur de bits de la caméra utilisée; dans notre cas, les images en niveaux de gris TIFF 16 bits ont été enregistrées. Les images RVB ont une profondeur de bits réduite, ce qui entraîne une perte d’informations; par conséquent, les images RVB ne conviennent pas à l’analyse d’images.

7. Analyse d’images

  1. Lisez les instructions et téléchargez le bloc-notes jupyter à partir de github (https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).
  2. Installez la distribution Python anaconda (https://www.anaconda.com/distribution/) version 3.6 ou supérieure.
  3. Ouvrez l’invite anaconda et tapez la commande d’installation pour Installer Simple ITK pour anaconda (https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk).
  4. Ouvrez le navigateur anaconda et lancez jupyter notebook. Il ouvrira un navigateur Web affichant les répertoires et les fichiers. Parcourez les structures de répertoires pour accéder au répertoire contenant le bloc-notes jupyter téléchargé à partir de github.
  5. Ouvrez le bloc-notes et exécutez chaque cellule en appuyant simultanément sur Maj et Entrée.
  6. Suivez les détails de chaque fonction et étape fournis dans le bloc-notes. Pour un ensemble d’images différent, il peut être nécessaire de modifier certaines valeurs de paramètre.
    REMARQUE: En bref, les noyaux sont segmentés à partir du canal DAPI à l’aide d’un seuil local avec une taille de bloc de 251 pixels, les trous ont été remplis et les objets de moins de 100 pixels supprimés. Les noyaux en contact ont été divisés à l’aide d’un algorithme de bassin versant. Le masque nucléaire a ensuite été dilaté de 100 pixels et le bassin versant a été utilisé pour séparer les objets en contact en utilisant des noyaux comme bassins. Pour identifier l’ARN à l’état d’équilibre (exons), le seuil d’Otsu a été utilisé; pour les allèles actifs transcriptionnels (intron), on a d’abord appliqué un flou gaussien (sigma=1), puis un seuil d’entropie maximale a été utilisé.

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Representative Results

Pour analyser les réponses hormonales via smFISH, à titre d’exemple, nous avons choisi le modèle de récepteur d’œstrogène (ER) utilisé dans les essais à haut débit pour déterminer la présence de perturbateurs endocriniens dans les catastrophes environnementales dans le cadre de la participation au programme de recherche NIEHS Superfund7. Dans cette expérience, les cellules adhérentes du cancer du sein MCF-7 ont été traitées avec l’agoniste ER 17β-estradiol (E2, 10 nM) ou véhicule (DMSO) pendant 24 heures. Les ensembles de sondes séparés spectralement par rapport aux séquences introniques GREB1 (Atto 647N, rouge sur la figure 1)et exoniques (Quasar 570, vert sur la figure 1)permettent la visualisation et la quantification simultanées de l’ARNm naissant et mature; Il est important de noter le nombre d’allèles transcriptionnellement actifs dans chaque cellule dont il a été démontré qu’ils faisaient partie du cours de temps de réponse des œstrogènes7.

Le protocole complété génère des projections d’intensité maximale (TIFF) de 16 bits pour chaque région d’intérêt. La segmentation nucléaire est effectuée à l’aide de noyaux colorés DAPI, et les limites cellulaires sont estimées en élargissant le masque nucléaire. Les signaux intron et exon GREB1 sont ensuite segmentés et attribués à chaque cellule individuelle. La figure 1 montre les images max-projetées déconcentrées et leur segmentation pour un échantillon traité avec du DMSO et de l’E2.

Figure 1
Figure 1 : exemples d’images smFISH et sortie de segmentation d’images. (A) Les cellules MCF-7, traitées avec du DMSO (panneau de gauche) et du 17β-estradiol (E2, panneau de droite) pendant 24h, ont été hybridées pour cibler les introns GREB1 (Atto 647N, ARNm naissant, rouge) et les exons GREB1 (Quasar 570, ARNm mature, vert). Les images sont acquises à 60x/1,42NA, déconvolées et l’intensité maximale projetée. (B) Les images de (A) sont traitées par le pipeline d’analyse d’images décrit qui définit le masque nucléaire, estime le masque cellulaire, identifie l’ARNm mature individuel et les allèles transcriptionnellement actifs. Les taches d’intron et d’exon GREB1 sont ensuite attribuées à des cellules individuelles. Barre d’échelle: 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Après le pipeline d’analyse d’images, nous avons obtenu le nombre de cellules qui ne touchaient pas les limites de l’image en nous basant sur l’imagerie de dix champs aléatoires par traitement, et il a été déterminé qu’il y avait 150 cellules traitées au DMSO et 149 cellules traitées à l’E2. Étant donné que les cellules aneuploïdes MCF-7 ont quatre copies du gène GREB1, et avec des sondes intron et exon, les signaux qui se chevauchent détermineront le nombre d’allèles et de cellules engagés dans la transcription active24. Nous avons déterminé la fraction de la population cellulaire pour chaque traitement qui avait de zéro à quatre allèles GREB1 actifs en comptant les taches d’intron et d’exons qui se chevauchent. Comme dans notre étude précédente, nous définissons les cellules transcriptionnellement actives comme celles qui présentaient deux ou plusieurs allèles GREB1 actifs7. Comme le montre la figure 2A-2B,les cellules traitées à l’E2 ont une fraction de cellules multipliée par 4 qui présentent deux allèles GREB1 actifs ou plus par rapport aux cellules traitées par véhicule7.

Figure 2
Figure 2 : Quantification du GREB1 induit par E2 au niveau cellule par cellule et allèle par allèle. (A) Distribution du nombre d’allèles GREB1 actifs par cellule comparant les cellules traitées par véhicule (barres bleues) et E2 (barres rouges). (B) Fraction de cellules considérées comme transcriptionnellement actives, définies ici comme des cellules avec deux ou plusieurs allèles GREB1 actifs7. (C) Distribution du nombre d’ARNm matures GREB1 par cellule pour chaque traitement. (D) Nombre moyen d’ARN/cellule mature GREB1 représenté comme valeur moyenne pour la population. Les barres d’erreur indiquent un écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les introns sont épissés à partir de l’ARNm naissant pour produire de l’ARNm mature qui se compose uniquement de séquences d’exons. Par conséquent, il est également possible de compter le nombre d’ARNm matures par cellule en quantifiant le nombre de taches vertes. La figure 2C-2D montre le changement de distribution de l’ARNm/cellule GREB1 mature et le changement de pli agrégé (20x) dans la population cellulaire après le traitement E2.

Conformément aux observations initiales sur 24 heures de traitement E2, toutes les cellules ne répondent pas de la même manière (c.-à-d. que les réponses sont hétérogènes dans la population MCF-7)7. Par exemple, le nombre d’ARNm GREB1 matures par cellule montre une vaste gamme d’expression (~ 15 fois) même dans les cellules traitées E2 sur 24 heures; Les méthodes de quantification de l’ARN en vrac ne permettent pas de discerner les niveaux de transcription variés dans les cellules par la moyenne statistique. Cela souligne le pouvoir de smFISH d’explorer des réponses hétérogènes cellule à cellule et allèle par allèle dans une population de cellules isogéniques.

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Discussion

La méthodologie smFISH décrite est basée sur les protocoles7,12,14publiés précédemment. Dans ce protocole, nous expliquons les étapes critiques qui ont été optimisées du laboratoire humide (y compris la densité d’ensemencement, le temps de fixation, la perméabilisation et la concentration de la sonde), à l’imagerie et à l’analyse d’images, fournissant un pipeline expérimental complet pour les laboratoires intéressés à effectuer une analyse unicellulaire de la transcription des gènes.

Pour faciliter l’analyse d’une seule cellule, il est important que les cellules soient sous-fluentes et ne se chevauchent pas afin que les frontières cellulaires soient estimées sans avoir besoin d’une limite cellulaire. Nous suggérons de compléter un test de prolifération cellulaire qui couvre un large éventail de densités d’ensemencement pendant toute la durée de l’expérience afin d’optimiser la densité cellulaire.

Déterminer le temps de fixation optimal est essentiel pour une expérience smFISH réussie. Nous avons constaté que la fixation des échantillons avec du formaldéhyde purifié à 4%, dilué dans du PBS stérile contenant du VRC pendant 30 minutes sur de la glace, améliore considérablement la cohérence des images smFISH de haute qualité, en particulier si une analyse structurelle est nécessaire via une combinaison d’anticorps contre des facteurs d’intérêt. Le formaldéhyde fixe les échantillons en réticulant des macromolécules et peut mieux maintenir les structures cellulaires que d’autres méthodes de fixation telles que celles utilisant des solvants organiques25. Cependant, le réglage du temps de fixation et de la température est nécessaire pour que l’échantillon spécifique ne surfixe ou ne soit pas fixant l’échantillon26. Le VRC est utile car il réduit la dégradation de l’ARN et est particulièrement utile pour l’ARN27faiblement abondant. Il y a deux options avec lesquelles nous avons eu du succès pour l’étape de la perméabilisation. Le premier est une incubation d’éthanol à 70% à 4 °C et le second est une incubation de 0,5% de Triton-X100 à température ambiante7,14. Il est possible d’effectuer le même protocole à haut débit en utilisant des plaques multipuits à fond de verre compatibles avec l’imagerie (96 et 384 puits). Le succès constant de smFISH a dépendu de l’utilisation de plaques de verre multipuits utilisant un fixateur contenant du VRC et 0,5% de Triton-X 100 avec VRC pour l’étape de perméabilisation. Bien que les plaques inférieures en plastique optique soient une option, la qualité d’image et le succès ont été nettement inférieurs.

Un rapport signal/bruit élevé est nécessaire pour l’analyse d’une seule cellule afin de filtrer le signal de fond et les faux positifs et d’identifier correctement les points limités par diffraction. Le signal d’arrière-plan s’ajoute aux valeurs d’intensité du signal d’intérêt. Un fond élevé résulte souvent d’une conception expérimentale sous-optimale, et bien qu’il soit soustrait des mesures d’intensité fluorescente, il est préférable d’imager initialement les régions d’intérêt avec le moins de signal de fond possible28. Une plage dynamique élevée, avec une différence minimale d’environ 10 fois, est nécessaire pour déterminer avec succès si le signal est considéré comme un signal d’arrière-plan ou d’intérêt29. Les points faussement positifs font référence à un signal résidant à l’extérieur des limites de la cellule, souvent en raison de couvercles mal nettoyés, d’un lavage insuffisant après l’hybridation ou de l’agrégation de sondes qui se produit lorsque les sondes s’associent elles-mêmes30. Si des signaux non spécifiques dus à une liaison fallacieuse de l’oligo-ensemble à des ARN différents de la cible se produisent (c’est-à-dire en raison de pseudogènes ou de similitudes de séquence), ceux-ci peuvent être évalués en testant les ensembles de sondes dans un modèle qui n’exprime pas le gène d’intérêt (c.-à-d. les MEF knock-out, CRISPR/Cas9 knock-out)31. De plus, comme pour toute expérience de microscopie à fluorescence, les sondes intron et exon doivent être séparées spectralement. Dans notre exemple d’expérience, nous avons choisi les colorants Atto 647N et Quasar 570 pour l’ensemble de sondes GREB1 car ils sont compatibles avec les spécifications des ensembles de filtres du microscope utilisé, résistants au photobleaching et ont un rendement quantique relativement élevé8,14,32. Selon l’échantillon, nous recommandons d’effectuer une série de dilution de la sonde mère (généralement une dilution de 1:200 à 1:1000, ou de 12,5 nM à 62,5 nM) pour identifier le meilleur rapport signal/bruit pour chaque ensemble de sondes spécifique. Certains fournisseurs fournissent des sondes étiquetées sur mesure avec des fluorophores sélectionnés par l’utilisateur pour augmenter la luminosité, réduire le photobleaching et, si nécessaire, ajouter 1-2 canaux supplémentaires généralement disponibles sur la plupart des microscopes fluorescents modernes7,8,14. Bien que smFISH ait la capacité de mesurer l’ARN de faible abondance, un problème clé est d’augmenter sa sensibilité et sa capacité à détecter l’ARN partiellement dégradé, en particulier pour les échantillons de tissus. Il est possible d’obtenir un rapport signal/bruit plus élevé en utilisant des sondes à ADN ramifiées conçues pour amplifier le signal, bien que nous n’ayons pas trouvé cette approche utile dans nos études33. Les microscopes confocaux utilisent une source de lumière focale pour éclairer l’échantillon tout en empêchant la lumière floue d’atteindre les détecteurs avec un ou plusieurs trous d’épingle. La microscopie confocale à balayage ponctuel est généralement déconseillée pour l’imagerie ARN-FISH car les sondes photopillent plus rapidement à partir de l’éclairage laser. Cependant, en fonction de l’échantillon et de l’intensité du signal, les microscopes confocaux peuvent générer des images avec peu ou pas de perte de signal8. Ici, nous avons utilisé un microscope à épifluorescence à large champ avec un objectif à fort grossissement et à grande ouverture numérique pour collecter le nombre maximum de photons émis par les sondes FISH34. Bien que les images puissent être floues par la lumière floue des plans adjacents de la pile z, des algorithmes de déconvolution réparatrice sont appliqués pour « réaffecter » la lumière diffractée entre les piles z acquises à son point d’origine34. Cela produit des images finales haute résolution pour l’analyse d’images. Si possible, il serait préférable de comparer empiriquement différentes modalités d’imagerie pour déterminer le système qui convient le mieux à votre expérience28.

Il existe de nombreuses extensions et applications possibles de smFISH. Dans notre expérience modèle, nous avons complété un cycle d’hybridation avec un ensemble de sondes pour le gène GREB1. Cependant, il est possible de compléter plusieurs tours de smFISH de manière séquentielle (seqFISH)13,35. Dans cette méthode, les ARNm dans la cellule sont marqués par des cycles séquentiels d’hybridation, d’imagerie, de décapage de sonde et de réhybride. Afin d’augmenter massivement le multiplexage jusqu’au niveau du transcriptome entier, des techniques de codage à barres ont été développées (par exemple, MER-FISH)36,37,38. Cela utilise une stratégie de code-barres de fluorescence pour identifier de manière unique chaque ARNm37,39. Ces techniques ont été adaptées aux tissus, et lorsqu’elles sont couplées à la microscopie à expansion, une méthode qui dilate physiquement un échantillon avec un réseau de polymères, peut fournir un accès accru des sondes aux ARN endogènes36,40,41. MER-FISH permet également d’augmenter la luminosité du signal de molécules individuelles par des techniques d’amplification du signal38. Le protocole que nous avons décrit est un processus de deux jours, cependant, il est possible de raccourcir le protocole smFISH afin que l’hybridation des sondes à l’ARN cible se produise en aussi peu que ~ 5 minutes (Turbo-FISH)26. L’immunofluorescence peut être combinée avec smFISH (IF-FISH) pour détecter simultanément les protéines et l’ARNm dans un seul échantillon42. Le protocole doit être optimisé pour les sondes FISH et les anticorps utilisés pour chaque expérience afin de réduire la dégradation des protéines et/ou de l’ARN dans l’échantillon, car certains matériaux (c’est-à-dire les tampons et les fixateurs) ne sont pas compatibles pour le traitement des protéines et de l’ARNm43. Reportez-vous à plusieurs publications de notre laboratoire comme exemples d’expériences IF-FISH réussies en plus des protocoles IF-FISH optimisés7,18.

En conclusion, nous présentons une méthode d’hybridation in situ par fluorescence à molécule unique (smFISH) qui fournit un aperçu de l’hétérogénéité d’une seule cellule et de la variation allèle par allèle en réponse au stimulus. Bien que ce protocole soit optimisé pour le système modèle décrit précédemment, nous fournissons une série d’ajustements possibles qui peuvent améliorer d’autres modèles de gènes cibles7.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

MAM, FS et MGM sont financés par niehs (Project 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM et PKS sont soutenus par le GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics (RP170719) financé par le CPRIT. L’imagerie est également soutenue par le noyau de microscopie intégrée du Baylor College of Medicine avec le financement des NIH (DK56338 et CA125123), du CPRIT (RP150578), du Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center et du John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β Estradiol Sigma-Aldrich E2257 CAS Number 50-28-2
Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free ThermoFisher Scientific AM9770
Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose Fisher Scientific MT10017CV Manufactured by Invitrogen
DAPI Sigma-Aldrich D8417 Without sodium pyruvate
Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile Sigma-Aldrich 3730-100ML
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ Corning 21030CV Manufactured by Calbiochem
Ethanol, 200 Proof (100%) Fisher Scientific 07-678-005
Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate Corning 353047 Manufactured by Decon Laboratories
Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL Fisher Scientific 50-753-2978 Manufactured by Gemini Bio Products
GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope GE Healthcare
Hyclone Water, Molecular Biology Grade Fisher Scientific SH3053802
Immersion Oil 1.516 GE Healthcare Life Sciences 29162940 Manufactured by GE Healthcare Bio-Science
L-glutamine Solution Fisher Scientific MT25005Cl Manufactured by Corning
MCF-7 cells ATCC HTB-22
Molecular Grade Formamide Promega PAH5051
Olympus 60x/1.42 NA Objective Olympus
Parafilm Bemis Company, Inc. 52858-076 Distributed by VWR
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
Penicilin-Streptomycin Solution Fisher Scientific MT3001Cl Manufactured by Corning
Ribonucleoside Vanadyl Complex VWR 101229-716 Manufactured by New England Biosciences
RNase Away Ambion 9780
Sodium pyruvate, 100 mM Fisher Scientific 11-360-070 Manufactured by Gibco
Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 Fisher Scientific 12-545-81P
Triton X-100, 100 mL Fisher Scientific BP151-100 Manufactured by Fisher BioReagents
Trypsin-EDTA Solution 0.25% Sigma-Aldrich T4049-500ML
Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL Fisher Scientific NC9265087 Manufactured by Vector Laboratories

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Analyse unicellulaire d’allèles transcriptionnellement actifs par molécule unique FISH
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Mistry, R. M., Singh, P. K., Mancini, M. G., Stossi, F., Mancini, M. A. Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH. J. Vis. Exp. (163), e61680, doi:10.3791/61680 (2020).

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