本文介绍一种易于使用的3D自组装心脏微组织阵列制备方法，该阵列由预先分化的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞组成。这种操作简便且所需细胞量少的心脏微组织制备技术，可用于疾病建模及药物研发的早期阶段。
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本文内容
摘要
摘要
由诱导性多能干细胞（iPSCs）生成人心肌细胞（CMs）、心脏成纤维细胞（CFs）和内皮细胞（ECs）为研究驱动心脏组织发育与疾病的多种心血管细胞类型之间的复杂相互作用提供了独特机遇。在心脏组织模型领域，已有多种复杂的三维（3D）方法利用诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs），结合细胞外基质和交联剂，以模拟生理相关性及天然组织微环境。然而，这些系统在缺乏微加工技术专长的情况下难以制备，且需要数周时间才能完成自组装。更为重要的是，这些系统大多缺少构成人类心脏中超过60%非心肌细胞的心脏血管细胞和心脏成纤维细胞。本文描述了从iPSCs中同时获得上述三种心脏细胞类型并构建心脏微组织的方法。这种简便的复制模塑技术可在标准多孔细胞培养板中实现心脏微组织的长期培养（数周）。该平台允许用户通过初始接种密度调控微组织尺寸，且仅需不到3天即可完成自组装并观察到心脏微组织的收缩活动。此外，心脏微组织可被轻松消化，同时保持较高的细胞活性，便于利用流式细胞术和单细胞RNA测序（scRNA-seq）进行单细胞水平的分析。我们预计该 体外 心脏微组织模型将有助于加速药物发现和疾病建模中的验证研究。
引言
心血管研究领域的药物发现和疾病建模由于缺乏临床相关样本和转化工具不足而面临诸多挑战1高度复杂的临床前模型或过度简化的模型 体外 单细胞模型无法以可重复的方式表现出病理生理条件。因此，多种微型化组织工程平台应运而生，旨在弥合这一差距，实现在高通量应用便捷性与组织功能真实再现之间的平衡2,3随着诱导性多能干细胞（iPSC）技术的出现，组织工程技术可应用于具有或不具有基础心血管疾病状态的患者特异性细胞，以回答科研问题4,5,6此类具有与心脏组织相似细胞构成的组织工程模型，可应用于药物开发中，用于检测由一种或多种细胞类型行为的病理变化所引起的心脏毒性和功能障碍。
由人iPSCs衍生的自组装微组织或类器官是三维（3D）结构，为微型的类组织聚集体，具有与其对应组织相似的功能特性 体内 对应物。有多种不同的方法可实现类器官的形成 原位 通过iPSCs的定向分化或拟胚体的形成4由此产生的类器官是研究驱动器官发生的形态发生过程不可或缺的工具。然而....
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方案
1. 培养基、试剂和培养板的制备
- 细胞培养用细胞洗涤液：使用不含钙和镁的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）或汉克斯平衡盐溶液（HBSS）。
- 心肌细胞分化培养基
- 通过将 10 mL 补充剂（50× B27 加胰岛素）加入 500 mL 心肌细胞基础培养基（RPMI 1640）中，制备分化培养基 #1。
- 通过将 10 mL 补充剂（50× B27 减胰岛素）加入 500 mL 心肌细胞基础培养基（RPMI 1640）中，制备分化培养基 #2。
- 通过将补充剂（50× B27 加胰岛素）加入 500 mL 无葡萄糖的心肌细胞基础培养基（RPMI 1640）中，制备纯化培养基 #3。
- 内皮细胞生长培养基及磁珠激活细胞分选（MACS）试剂
- 使用市售内皮细胞生长培养基补充剂试剂盒配制内皮细胞生长培养基（EGM）。
- 通过将牛血清白蛋白（BSA）储备液用洗涤液按 1:20 稀释，制备细胞分离分选缓冲液。
- 心脏成纤维细胞分化培养基：使用成纤维细胞基础培养基（DMEM 高糖）和无血清成纤维细胞生命因子试剂盒配制心脏成纤维细胞分化培养基。
- 心脏微组织构建与维持培养基：将心肌细胞基础培养基（RPMI 1640）与补充剂（50× B27 加胰岛素）和 EGM 按 70/30 体积比混合，过滤后....
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结果
诱导多能干细胞来源的心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞的免疫染色与流式细胞术表征
为了构建由iPSC-CMs、iPSC-ECs和iPSC-CFs组成的 cardiac microtissues（心脏微组织），需对这三种细胞类型分别进行分化与表征。体外将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为iPSC-CMs的技术在过去数年中已显著改进。然而，不同细胞系之间iPSC-CMs的产量和纯度仍存在差异。本方案所获得的iPSC-CMs纯度超过75%，并在分化第9天左右开始自发搏动（图1A）。通过在第9至第14天之间进一步纯化，可将iPSC-CMs的纯度提升至80%以上，具体方法如先前所述12。类似地，采用已发表的方案13,14，通过在分化第4–5天添加多种血管生长因子，可诱导来自中胚层的内皮前体细胞极化，从而获得高纯度的iPSC-ECs，并形成表型明确的内皮细胞（
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讨论
为了从预先分化的心肌细胞（iPSC-CMs）、内皮细胞（iPSC-ECs）和成纤维细胞（iPSC-CFs）生成心脏微组织，必须获得高纯度的细胞培养物，以便在心脏微组织内细胞接触抑制性压缩后更精确地控制细胞数量。最近，Giacomelli 等人18已展示了利用 iPSC-CMs、iPSC-ECs 和 iPSC-CFs 制备心脏微组织的方法。采用所述方法生成的心脏微组织包含约 5,000 个细胞（70% iPSC-CMs、15% iPSC-ECs 和 15% iPSC-CFs）。在该方法中，心肌细胞和内皮细胞被共分化，随后利用 CD34+ 标记物分离内皮祖细胞。本文所述的现有方案中，每个微组织包含 12,000 个细胞（70% iPSC-CMs、20% iPSC-ECs 和 10% iPSC-CFs），从而为后续的单细胞分析提供了更高数量的细胞。此外，由于这三种细胞类型均为独立分化，细胞群体的异质性较低，有助于特异性地研究不同细胞对处理的响应。
在心肌细胞分化方面，我们及其他研究者此前已证明，可在化学成分明确的培养条件下获得纯化的心肌细胞.......
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披露
J.C.W. 是 Khloris Biosciences 的联合创始人，但不存在竞争利益，因为本文所展示的工作完全独立。其他作者报告无利益冲突。
致谢
感谢Amanda Chase博士对本文手稿提供的有益反馈。本研究获得了加州大学烟草相关疾病研究项目（TRDRP）的资助，项目编号为T29FT0380（D.T.）和27IR-0012（J.C.W.）；美国心脏协会资助编号20POST35210896（H.K.）和17MERIT33610009（J.C.W.）；以及美国国立卫生研究院（NIH）资助编号R01 HL126527、R01 HL123968、R01 HL150693、R01 HL141851，以及NIH UH3 TR002588（J.C.W.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12孔板 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D 微型模具 | 微组织 | 12-81 格式 | |
| 6孔板 | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS 冲洗液 | 赛默飞世尔科技 | NC9104697 | |
| B27 补充剂（不含胰岛素） | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 补充剂加胰岛素 | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD 生物科学 | 554655 | |
| BD Matrigel，hESC认证基质 | BD 生物科学 | 354277 | |
| 心肌肌钙蛋白T抗体 | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144（VE-钙黏蛋白）MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 抗体 | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 微珠 | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Annexin V FITC/PI 凋亡与死细胞检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | V13242 | |
| Dispase I | 默克生命科学 | 4942086001 | |
| DMEM，高糖（4.5 g/L），无谷氨酰胺培养基 | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 基础培养基 | Gibco | 11320033 | |
| 不含钙、镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS） | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife 无血清成纤维细胞培养基套装 | LifeLIne 细胞技术 | LS-1010 | |
| 无葡萄糖 RPMI 培养基 | Life Technologies | 11879-020 | |
| 山羊血清 | Life Technologies | 16210-064 | |
| 人碱性成纤维细胞生长因子 | 赛默飞世尔科技 | 13256029 | |
| 人 VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS 分选柱 | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA 储存液 | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS 洗涤缓冲液 | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS 分离器 | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI 培养基 | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | 赛默飞世尔科技 | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | 赛默飞世尔科技 | 红色 | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488标记抗体 | R&D Systems | IC2105G |
参考文献
- Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a....
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