本文描述了一种用于确定日本李型杂交种授粉需求的方法，该方法结合了田间和实验室授粉，通过荧光显微镜观察花粉管，并利用PCR鉴定S-基因型，同时监测开花情况以筛选授粉品种。
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本文内容
摘要
摘要
常见的日本李栽培品种是由原产的Prunus salicina与其他Prunus物种杂交获得的种间杂种。大多数杂种表现出配子体型自交不亲和性，该特性由一个单一位点、高度多态性的S-位点控制，该位点包含多个等位基因。大多数栽培杂种具有自交不亲和性，需要来自亲和授粉品种的花粉来完成其花朵的受精。由于大量新品种的授粉需求尚未明确，确定日本李的授粉要求正变得日益重要。本文描述了一种用于确定日本李类型杂种授粉需求的方法体系。通过在田间和实验室条件下进行人工授粉，随后利用荧光显微镜观察花粉管伸长情况，并结合田间果实成熟情况的监测，来判定其自交（不）亲和性。通过结合PCR分析鉴定S-基因型以及田间开花期的观测，评估授粉品种的选择。了解品种的授粉需求有助于在新建果园时合理选配品种，并可在已有果园中及早发现因授粉不足导致的产量问题。
引言
日本李（Prunus salicina 林德（Lindl.）原产于中国1. 在19th 20世纪，该作物从日本引入美国，在美国与其它北美二倍体李子进行了杂交2. 在20th 世纪，其中一些杂交种被传播到世界各地的温带地区。如今，“日本李”这一术语指的是由原始种间杂交产生的一系列种间杂交种 P. salicina 包含另外多达15个二倍体 李属 种（spp.）3,4,5.
梅（日本李）与其他蔷薇科（Rosaceae）物种一样，表现出配子体型自交不亲和性（GSI），该特性由一个单一位点、高度多态的 S-位点控制，该位点包含多个等位基因6。该 S-位点包含两个基因，分别编码在雌蕊中表达的核糖核酸酶（S-RNase）和在花粉粒中表达的F-box蛋白（SFB）7。在自交不亲和反应中，当花粉粒（单倍体）所表达的 S-等位基因与雌蕊....
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方案
1. 田间人工授粉
- 花粉提取
- 为获得花粉，需在D期采集花蕾24，依据BBCH标度的57期25,26.
注意：日本李所需的花芽数量比其他植物更多 李属 因为它们的花药产生的花粉较少。 - 使用塑料网筛（孔径2 mm × 2 mm）去除花药，并将其置于室温下的纸面上放置24小时，直至花药开裂。
- 将花粉粒通过细网筛（孔径0.26 mm × 0.26 mm）筛分，并置于带盖的10 mL玻璃管中，4 °C保存备用。
- 为获得花粉，需在D期采集花蕾24，依据BBCH标度的57期25,26.
- 去雄花朵的授粉
- 当10%–20%的花朵开放时，选择并标记若干枝条。去除已开放的花朵和幼小花蕾，仅保留D期的花蕾24，依据BBCH标度的第57阶段25,26.
- 用指甲或镊子去除每个处理组800至1,000个花蕾的花瓣、花萼和雄蕊。
- 去雄后24小时，使用细小的画笔对雌蕊进行人工授粉。部分枝条上的一半雌蕊用同....
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结果
每个日本李子花芽包含一个由1–3朵花组成的花序。与其他核果类植物一样，每朵花由四个花部轮生结构组成：雌蕊、雄蕊、花瓣和萼片，这些结构在基部融合形成杯状结构。花的结构比其他核果类植物更小，具有短而脆弱的雌蕊，周围环绕着含有少量花粉粒的雄蕊。在开花前，每朵花序的花在短花梗上彼此分离，白色花瓣展开呈气球状，外围被绿色萼片包围（花期D阶段，57 BBCH）（图1A）。开花时花朵完全开放，露出花药和雌蕊（花期F阶段，65 BBCH）（图2A）。与其他温带Prunus spp.类似，花芽先开放，叶芽则在数天后萌发。这使得开花的树木显得极为壮观，满树繁花而无叶片。
日本李的人工授粉需要在花开放前的气球期采集花朵（图1A），此时雌蕊和雄蕊几乎发育成熟，但花药尚未开裂。此阶段可防止携带外来花粉的昆虫进入，因为花瓣仍处于闭合状态。尽管其花朵数量远高于其他Prunus物种，但其中大多数（85.......
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讨论
本文所述的日本李栽培品种授粉需求研究方法，需通过田间或实验室控制授粉来确定各栽培品种的自交（不）亲和性，并利用荧光显微镜观察花粉管的生长情况。通过分子基因分型对S-等位基因进行表征，从而建立不亲和性关系。最后，通过监测物候期，筛选每年开花期相吻合的栽培品种，以完成授粉品种的选择。
由于新培育的日本李类型品种数量众多，且大多数品种的授粉需求未知并表现为自交不亲和性，因此明确这些新品种的授粉需求正变得愈发重要3。本文所述的方法结合了物候期监测、人工控制授粉、荧光显微镜观察以及分子基因分型技术，已被证实可用于有效确定品种的授粉需求14。
日本李的杂交种具有一些特殊性，这使得无法像其他Prunus物种那样采用单一方法来确定其授粉需求。首先，其花朵较小且更为脆弱3。花粉的提取与处理方法与其他Prunus spp.
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由西班牙国家农业与食品技术研究所（Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria，项目编号：RFP2015-00015-00 和 RTA2017-00003-00）、阿拉贡自治区政府—欧洲社会基金、欧盟（Grupo Consolidado A12-17R）、埃斯特雷马杜拉自治区政府—欧洲区域发展基金（FEDER）、地区研究计划（IB16181）以及研究小组项目（AGA001，GR18196）资助。B.I. Guerrero 获得墨西哥国家科学技术理事会（Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México，CONACYT，编号 471839）奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 冰乙酸 | Panreac | 131008.1611 | |
| 琼脂 | iNtRON Biotechnology | 25999 | |
| 苯胺蓝 | Difco | 8504-88 | |
| 硼酸 (H3BO4) | Panreac | 131015.1210 | |
| 四水合硝酸钙 (Ca(NO3)2·4H2O) | Panreac | 131231.1211 | |
| 盖玻片 | Deltalab | D102460 | 24 mm x 60 mm |
| 数码相机 | Imaging Developmet Systems | UI-1490SE | |
| 数码相机软件套件 | Imaging Developmet Systems | 4.93.0. | |
| DNA 寡核苷酸 | ThermoFisher Scientific | ||
| dNTP 混合液，每种 10 mM | ThermoSischer Scientific | R0193 | |
| DreamTaq Green DNA 聚合酶 | ThermoFisher Scientific | EP0713 | |
| 96°乙醇 | VWR-Chemicals | 83804.360 | |
| 1Kb DNA 标准分子量标记（美国专利号 4.403.036）(500bp-12Kb) | Invitrogen | 15615-016 | 大小：250µg；浓度：1.0 µg/µl |
| 凝胶成像系统 | Bio-Rad | 1708195 | |
| 手动计数器 | Tamaco | TM-4 | |
| Image Lab 软件 | Bio-Rad | 凝胶成像系统的图像分析系统 | |
| MetaPhor 琼脂糖 | Lonza | 50180 | |
| 5415 R 微型离心机 | Eppendorf | Z605212 | |
| 带紫外落射荧光的显微镜 | Leica | DM2500 | 激发滤光片 BP340-390，阻断滤光片 LP425 |
| 载玻片 | Deltalab | D100004 | 26 mm x 76 mm |
| 小型电泳系统 | Fisherbrand | 14955170 | |
| 微型离心机 | ThermoFisher Scientific | 15334204 | |
| NanoDrop 1000 分光光度计 | ThermoFisher Scientific | ND1000 | |
| 培养皿 | Deltalab | 200201 | 55 mm x 14 mm |
| 磷酸三钾 (K3PO4·1.5H2O) | Panreac | 141513 | |
| 正向引物 'Pru C2' | ThermoFisher Scientific | ||
| 正向引物 Pru T2' | ThermoFisher Scientific | ||
| 反向引物 'PCER' | ThermoFisher Scientific | ||
| RedSafe 核酸染色液 | iNtRON Biotechnology | 21141 | |
| 蔗糖 | Panreac | 131621.1211 | |
| 无水亚硫酸钠 (Na2SO3) | Panreac | 131717.1211 | |
| Speedtools 植物DNA提取试剂盒 | Biotools | 21272 | |
| TBE 缓冲液 (10X) | Panreac | A0972,5000PE | |
| Thermal Cycler T100 | Bio-Rad | 1861096 | |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | T1317 | |
| 垂直高压灭菌器 Presoclave II | JP Selecta | 4001725 | |
| 涡旋振荡器 | Fisherbrand | 11746744 |
参考文献
- Hendrick, U. P. The Plums of New York. , J. B. Lyon Co., State Printers. (1911).
- Okie, W. R., Hancock, J. F. Plums. Temperate Fruit Crop Breeding. Hancock, J. F. , Springer. Dordrecht. 337-357 (2008).
- Guerra, M. E., Rodrigo, J.
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重印与许可
