通过去除头骨和皮肤实现清醒斑马鱼幼虫和幼鱼全脑组织的活体成像

摘要

本文介绍一种对斑马鱼胚胎大脑进行活体成像的方法，可观察至幼虫期和稚鱼期。该方法借鉴电生理学技术，属于微创操作，能够获取成熟神经元的细胞及亚细胞结构细节，并可与光遗传学及神经药理学研究相结合，用于表征脑功能及药物干预效果。

摘要

要理解大脑发育和成熟过程中发生的短暂变化，需要在细胞和亚细胞分辨率下，对空间和时间进行高分辨率的详细成像。分子与成像技术的进步使我们能够深入洞察透明斑马鱼胚胎中大脑发育的细胞与分子机制。近年来，研究的关注点已转向受精后数周的幼虫后期阶段发生的神经连接精细化过程，例如社会行为、决策或动机驱动行为的调控机制。在这些发育阶段，斑马鱼皮肤的色素沉积会阻碍光线进入脑组织，而胚胎期常用的解决方案（如药理学抑制色素生成）已不再可行。

因此，提供了一种源自电生理学 方法的微创外科手术方案，可实现对清醒斑马鱼大脑进行显微成像的通路。在硬骨鱼类中，可通过显微剥离技术小心去除皮肤和柔软的颅骨软骨层，从而暴露下方的神经元和轴突通路，且不造成损伤。该方法可用于记录神经元形态，包括突触结构及其分子组成，并可观察生理变化，如钙离子（Ca²⁺）瞬变或细胞内运输事件。此外，还可通过药理学抑制或光遗传学操控手段对这些过程进行干预研究。这种脑部暴露方法可在数分钟至数小时的时间尺度上，提供活体脑组织中神经元结构与生理变化的信息，以及这些事件之间的相关性和相互依赖关系。该技术适用于受精后长达30天的斑马鱼幼鱼的活体脑成像，这是目前测试的最晚发育阶段。因此，该方法可用于研究突触精细化与缩放、轴突和树突运输、细胞骨架货物的突触靶向以及局部活动依赖性表达等重要科学问题。综上所述，这种固定与成像方法具有广泛的应用前景。

引言

在最近几十年中，斑马鱼（Danio rerio斑马鱼已成为胚胎和幼体发育研究中最受欢迎的脊椎动物模式生物之一。雌性斑马鱼具有较高的繁殖力，且其胚胎发育迅速 子宫外 胚胎的发育过程及其在早期胚胎发育阶段的透明性，是使斑马鱼成为研究发育问题的强大模式生物的几个关键因素之一¹分子遗传技术的进步与高分辨率相结合 体内 成像研究有助于揭示发育过程背后的细胞生物学机制²特别是在神经元分化、生理学、连接性和功能领域，斑马鱼以前所未有的细节揭示了分子动态、脑功能与有机体行为之间的相互作用。

然而，大多数研究仅限于发育第一周内的胚胎期和早期幼虫阶段，因为神经系统组织的透明度会逐渐丧失。在这些阶段，由于颅骨分化和色素沉着的形成，脑组织被遮蔽，无法被高分辨率显微镜技术所观察³。

因此，神经元分化、成熟和可塑性等关键问题，例如神经元连接的精细化或突触缩放，难以进行研究。这些细胞过程对于阐明驱动社会行为、决策或基于动机行为的细胞机制至关重要；近年来，针对数周龄斑马鱼幼鱼的行为学研究已在这些领域取得了重要发现⁴。

使用药理学方法抑制斑马鱼幼鱼的色素沉着....

方案

本文所述所有动物实验均符合相关法律法规（欧盟指令2010/63）。鱼类的饲养与操作已获得当地主管部门以及布伦瑞克工业大学动物福利代表的批准。

1. 人工脑脊液（ACSF）、低熔点琼脂糖和尖细玻璃针的制备

1. 通过将所列化学物质以以下浓度溶解于蒸馏水中来配制人工脑脊液（ACSF）：134 mM NaCl（58.44 g/mol）、2.9 mM KCl（74.55 g/mol）、2.1 mM CaCl₂（110.99 g/mol）、1.2 mM MgCl₂·6H₂O（203.3 g/mol）、10 mM HEPES（238.31 g/mol）和10 mM d-葡萄糖（180.16 g/mol）。
   注意：对于MgCl₂、CaCl₂和KCl，使用去盐无菌水配制1 M的储存液，并于4 °C保存，用于后续新鲜ACSF的配制。葡萄糖、HEPES和NaCl以固体形式直接溶解于新鲜ACSF溶液中。溶解化学品时，请遵循制造商的说明。
2. 使用10 M NaOH将ACSF的pH值调节至7.8。ACSF的配制需要精确称量化学品并精细调节pH值，因为它将替代脑脊液，维持神经元正常功能所需的生理条件；否则可能导致脑功能异常和神经元死亡。
3. 将新配制的ACSF于4 °C保存，最长不超过4周。实验时，取当日或当次实验所需体积的ACSF分....

结果

图3A，C 显示转基因品系 Tg[-7.5Ca8:GFP] 的 14 天龄幼鱼^bz1215] 颅骨仍保持完整，覆盖其上的皮肤色素细胞分布于整个头部，在目标区域（此处为小脑）干扰了荧光信号。在此状态下，无法对幼鱼脑部获取高分辨率图像。 图3B 显示了同一转基因品系幼虫在完成开颅手术后的状态。此时，目标区域已完全暴露，激发激光和发射的荧光可直接穿透组织，避免了散射和反射。对该幼虫采集的图像将获得高分辨率的精细图像。图3D），可与离体脑成像相媲美，但其优势在于脑组织仍处于完全活跃状态。此外，由于无需使用多聚甲醛固定，脑组织不会像固定后摘除的脑样本那样发生荧光强度的损失。在颅骨打开的幼虫中，脑组织可直接接触，神经元保持完全活性，所有生理连接完整，并能正常接收来自感觉系统的感觉输入.......

讨论

所介绍的方法提供了一种替代方案，用于斑马鱼幼鱼脑组织的分离或通过药物处理抑制其色素沉着，以便对神经元进行高分辨率成像记录 体内 环境。采用该方法记录的图像质量可与离体脑组织的图像相媲美，且是在自然条件下实现的。

此外，由于无需使用固定剂处理¹⁸，因此可避免荧光强度的减弱。同时，该方法不像脑组织分离那样具有侵入性，且仅包含一个可能导致失败的关键步骤，因此与脑组织分离相比，成功制备的概率更高。最重要的优势在于，该方法适用于活体（in vivo）成像记录。只要颅骨开窗操作精确、迅速且成功，并定期监测人工脑脊液（ACSF）的氧饱和度，脑组织应可在数小时内保持完全功能和活性。根据电生理记录、血液循环、呼吸状况以及鱼类在术后数天的存活情况，我们认为去除皮肤和颅骨对整体健康无明显不利影响。因此，该方法可用于健康且功能正常的脑组织中细胞和亚细胞过程的实时成像，且不会受到干扰成像的色素沉着影响。本方法在本实验室是用于活体（in vivo）神经元活动电生理记录的标准操作，并在全球其他电生理实验室中也已.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钙	Roth	A119.1
共聚焦激光扫描显微镜	Leica	TCS SP8
D-葡萄糖	Sigma	G8270-1KG
D-筒箭毒碱	Sigma-Aldrich	T2379-100MG
玻璃毛细管类型1	WPI	1B150F-4
玻璃毛细管类型2	Harvard Apparatus	GC100F-10
玻璃盖玻片	deltalab	D102424
HEPES	Roth	9105.4
Hoechst 33342	Invitrogen (Thermo Fischer)	H3570
成像培养皿	Ibidi	81156
氯化钾	Normapur	26764298
LM-琼脂糖	Condalab	8050.55
氯化镁（六水合物）	Roth	A537.4
显微镜相机	Leica	DFC9000 GTC
针头拉制仪类型1	NARISHIGE	Model PC-10
针头拉制仪类型2	Sutter Instruments	Model P-2000
巴斯德移液管 3ml	A.Hartenstein	20170718
氯化钠	Roth	P029.2
氢氧化钠	Normapur	28244262
三卡因	Sigma-Aldrich	E10521-50G
水浴锅	Phoenix Instrument	WB-12
35 mm 培养皿	Sarstedt	833900
90 mm 培养皿	Sarstedt	821473001