使用氟磷钙标签和纳米粒子跟踪分析估计人类泌尿纳米晶体

Summary

这项研究的目的是确定纳米粒子跟踪分析（NTA）能否检测和量化含有健康成年人纳米晶体的尿钙。目前的研究结果表明，NTA可能是估计肾结石疾病期间泌尿纳米晶体的潜在工具。

Abstract

肾结石在全世界成人和儿童中越来越普遍。最常见的肾结石类型由草酸钙（CaOx）晶体组成。当尿液中富含矿物质（如钙、草酸盐、磷酸盐）并形成肾结石之前时，就会发生结晶。评估石器晶体的标准方法包括显微镜、过滤和离心。然而，这些方法主要检测微晶体，而不是纳米晶体。纳米晶体被建议对肾脏上皮细胞的危害大于体外微晶体。在这里，我们描述了纳米粒子跟踪分析（NTA）检测人类泌尿纳米晶体的能力。健康成年人在饮用草酸盐负荷以刺激泌尿纳米晶体之前，先吃受控的草酸盐饮食。尿在草酸盐负荷前后收集了24小时。用乙醇加工和清洗样品以净化样品。泌尿纳米晶体沾染了钙结合氟磷，氟-4 AM。染色后，使用 NTA 确定纳米晶体的大小和计数。这项研究的结果表明，NTA可以有效地检测健康成年人的纳米晶体。这些发现表明，NTA可能是肾结石患者纳米晶体的有价值的早期检测方法。

Introduction

当尿液中富含矿物质时，尿晶体就会形成。这可能发生在健康的人，但更常见的个人肾结石^1。泌尿晶体的存在和积累会增加患肾结石的风险。具体来说，当晶体与兰德尔的斑块结合，核化，积累，并随着时间的推移生长^2，3，4时^，就会发生这种情况。晶体在肾结石形成之前和晶体的评估可能具有预测价值的肾结石前^3，5。具体来说，结晶体已被建议有用，以预测在含有结石^6，7的草酸钙病史患者的结石复发的风险。

据报道，晶体对肾上皮和循环免疫细胞功能^{8、9、10、11、12、13}产生负面影响。

Protocol

这项工作中概述的所有实验都得到了阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）机构审查委员会的批准。健康成人（33.6±3.3岁;n=10）如果有正常的血液综合代谢板，非烟草使用者，非怀孕，体重指数在20-30公斤^/米2之间，并且没有慢性疾病或急性疾病，则报名参加研究。健康参与者在研究开始前签署了书面知情同意书。

1. 临床协议和尿液收集

1. 让参与者在收集尿液（24 小时样本）之前，先食用由 UAB 临床和转化科学中心准备的低草酸盐饮食 3 天，并快速过夜。
2. 第二天，让参与者在食用草酸盐（含有水果和蔬菜的冰沙，约8毫米草酸盐）之前返回其24小时尿样（草本前）。参与者随后收集尿液24小时（牛酸后样本），第二天返回尿液。
3. 在处理前在室温下保持所有尿液样本（RT），如下图 1所示。

2. 尿液处理

注:所有使用的材料和设备都列在 材料表中。
注意:在处理临床样品和试剂时，时刻佩戴个人防护装备。具体来说，手套、脸部和眼罩、呼吸保护和防护服。

1. 测量和记录尿液pH度和体积。在将 50 mL 尿液添加到标记的无菌 50 mL 圆锥管中之前，彻底混合。
2. 使用台式离心机....

Results

这项研究的结果表明，NTA可以有效地检测人类尿液中含有尿纳米晶体的钙的平均大小和浓度。这是通过使用氟磷、氟-4 AM 和纳米粒子跟踪分析实现的。Fluo-4 AM 能够与 CaOx 和 CaP 晶体结合。如图3A所示，CaOx晶体的大小确定在50-270纳米之间，平均浓度为1.26 x 10⁹颗粒/mL。CaP晶体的大小在30-225纳米之间，平均浓度为2.22×10⁹粒子/mL（图3B）。为了确定NTA能否评估人类尿液中的纳米晶体，健康成年人被要求食用受控的草酸盐饮食，然后摄入高草酸盐。收集负荷前后的24小时尿液样本，以评估尿纳米晶体大小和浓度。草前尿液样本中含有一些尿纳米晶体（1.65 x 10⁸ ± 3.29 x 10⁷颗粒/mL）在 110-300 nm 之间（图 4）。相比之下，氧化后样品（7.05 x 10^8< ±1.08 x 10 .......

Discussion

NTA在本研究中使用钙结合探针Flo-4 AM来评估人类尿液中的纳米晶体。没有标准方法可以检测尿液中的纳米晶体。一些研究小组已经检测出尿液中的纳米晶体，并依靠使用广泛的协议或方法，这些协议或方法限制了他们量化样本^的能力。这项研究展示了一种特定而敏感的方法，用于检测参与饮食喂养研究的人类尿液中含有纳米晶体的钙，该研究包括摄入高草酸盐负荷。草酸盐的消耗量相当于实际世界中草酸盐的消耗量（例如，1/2菠菜沙拉）。

NTA是一种具有良好特征的高分辨率工具，它使用布朗运动测量解决方案³⁰中的粒子。它已用于评估生物纳米粒子的各种生物样本^{31，32，33。}此外，NTA 可以准确预测任何类型的生物样本中颗粒的大小和浓度。此方法不需要任何标签:但是，标签.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
台式离心机	Jouan 离心机	CR3-12
草酸钙一水合	如前所述在实验室合成29。		在 RT 储存;储存 10 mM
磷酸钙晶体（羟基磷灰石纳米粉末）	Sigma	677418	储存在 RT;在 RT 储存 10 mM
乙醇	Fischer Scientific	AC615095000	;原液 100%
Fluo-4 AM*	AAT Bioquest， Inc.	20550	储存在冷冻室 （-20°C;C);库存 5 mM
金纳米颗粒	Sigma	742031	储存在 2-8°;C
NanoSight 仪器	英国马尔文仪器	NS300
注射泵	哈佛仪器	98-4730
Virkon 消毒剂	LanXESS Energizing Company，德国	LSP
*荧光染料对光敏感;原液和等分试样应在 -20&°C 的黑暗中储存。