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方法文章

3D打印 体外 通过交替黏性-惯性力喷射法制备水凝胶微载体

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DOI：

10.3791/62252

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2021年4月21日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomanufacturing Center, Dept. of Mechanical Engineering, Tsinghua University, 2Biomanufacturing and Rapid Forming Technology Key Laboratory of Beijing, 3Department of Mechanical Engineering, Drexel University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种由交变粘性-惯性力驱动的温和3D打印技术，可用于构建水凝胶微载体。自制喷嘴具有灵活性，可方便地更换以适应不同材料和直径。可获得并收集直径为50-500 µm的细胞结合微载体，用于后续培养。

摘要

微载体是直径为60-250 µm、具有较大比表面积的微珠，常用于大规模细胞培养的载体。微载体培养技术已成为细胞学研究中的主要技术之一，广泛应用于大规模细胞扩增领域。微载体在体外组织工程构建和临床药物筛选中也显示出日益重要的作用。in vitro组织工程构建和临床药物筛选。目前制备微载体的方法包括微流控芯片和喷墨打印技术，这些方法通常依赖于复杂的流道设计、不相容的两相界面以及固定的喷嘴形状。这些方法在应用于多种生物墨水时，面临喷嘴加工复杂、更换喷嘴不便以及挤出力过大的挑战。本研究采用一种称为交替黏性-惯性力喷射的3D打印技术，实现了直径为100-300 µm的水凝胶微载体的构建。随后将细胞接种于微载体上，形成组织工程模块。与现有方法相比，该方法具有喷嘴尖端直径自由可调、喷嘴切换灵活、打印参数可自由控制以及适用于多种生物活性材料的温和打印条件等优势。

引言

微载体是直径为60-250 µm、具有较大比表面积的微珠，常用于细胞的大规模培养1,2。其外表面为细胞提供了丰富的生长位点，内部则为细胞的空间增殖提供了支撑结构。球形结构还便于对pH、O2以及营养物质和代谢产物浓度等参数进行监测和控制。当与搅拌式生物反应器联合使用时，微载体可在相对较小的体积内实现比传统培养更高的细胞密度，从而为大规模培养提供了一种经济有效的方法3。微载体培养技术已成为细胞学研究中的主要技术之一，在干细胞、肝细胞、软骨细胞、成纤维细胞及其他结构的大规模扩增领域已取得显著进展4。此外，微载体也被认为是理想的药物递送载体和自下而上的构建单元，因此在临床药物筛选和体外组织工程修复中发挥着日益重要的作用5。

为了满足不同应用场景下的力学性能要求，已开发出多种类型的水凝胶材料用于微载体的构建6,7,8,9,10,11。海藻酸盐和透明质酸（HA）水凝胶是两种最常用的微载体材料，因其具有良好的生物相容性和可交联性12,13。海藻酸盐可通过氯化钙轻松交联，并可通过改变交联时间来调节其力学性能。酪胺修饰的透明质酸（HA）则通过过氧化氢和辣根过氧化物酶催化的酪胺基团氧化偶联实现交联14。胶原蛋白由于其独特的螺旋结构和交联纤维网络，常被作为辅助材料添加至微载体中，以进一步促进细胞黏附15,16。

目前制备微载体的方法包括微流控芯片、喷墨打印和电喷雾17,18,19,20,21,22,23。微流控芯片已被证实可快速高效地生成尺寸均一的微载体24。然而，该技术依赖于复杂的流道设计和制造工艺25。喷墨打印过程中可能产生高温或过大的挤出力，而电喷雾方法中存在强电场，这些因素均可能对材料的性能产生不利影响，尤其是其生物活性19。此外，当应用于多种生物材料和不同直径时，这些方法所使用的定制喷嘴导致加工复杂性受限、成本较高且灵活性较低。

为了提供一种便捷的微载体制备方法，已应用一种名为交替黏性-惯性力喷射（AVIFJ）的3D打印技术来构建水凝胶微载体。该技术利用垂直振动过程中产生的向下驱动力和静压，克服喷嘴尖端的表面张力，从而形成液滴。与强烈的外力或高温条件不同，AVIFJ在打印过程中仅对喷嘴施加微小而快速的位移，对生物墨水的理化性质影响较小，因而对生物活性材料具有显著优势。利用AVIFJ方法，成功制备了多种生物材料组成的微载体，其直径为100–300 µm。此外，这些微载体被进一步证实能够良好地结合细胞，并为贴壁细胞提供适宜的生长环境。

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方案

1. 细胞培养

  1. 在高糖 Dulbecco 改良最低必需培养基（H-DMEM）中添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 非必需氨基酸溶液（NEAA）、1% 青霉素 G 和链霉素，以及 1% 谷氨酰胺补充剂，配制成 A549 细胞的培养基。
  2. 将 A549 细胞在 37 °C、5% CO2 的 CO2 培养箱中培养。
  3. 当细胞融合度达到约 80% 时，使用胰蛋白酶消化进行传代。
    1. 在 T75 培养瓶中加入 3 mL 胰蛋白酶，在 37 °C 下处理 3 分钟，然后加入 6 mL 培养基以终止消化。
    2. 用移液器吹打培养基，收集松散贴壁的细胞。
    3. 以 72.5 × g 离心 3 分钟，弃去上清液，并用 3 mL 新鲜培养基重悬细胞。
    4. 将 1 mL 细胞悬液转移至含有 10 mL 新鲜培养基的新 T75 培养瓶中。每 2 天更换一次培养基。

2. 喷嘴的制备

  1. 按照制造商的说明将玻璃微量移液管装载到拉制仪上。微喷管的外径、内径和长度分别为 1.5 mm、1.1 mm 和 100 mm。
  2. 设置拉制仪的拉制参数。默认情况下，HEAT、PULL、VELOCITY、TIME 和 PRESSURE 的值分别设置为 560、255、255、150 和 500。在此参数下拉制喷嘴。
    警告：拉制后的喷嘴非常尖锐，操作不慎可能导致伤害。
  3. 使用微加工设备，按照制造商的说明在指定直径处切断所得喷嘴（步骤 2.2），以获得特定的尖端直径。具体操作为：将喷嘴的指定直径部分置于加热的铂丝上，将铂丝加热至约 60 °C，持续约 5 秒，然后将喷嘴拉开。
  4. 将喷嘴的喷头浸入疏水剂中 30 分钟，随后用无菌水冲洗三次。
  5. 打印前，将喷嘴在酒精中灭菌 5 分钟，并用无菌水冲洗三次，以去除残留的酒精。

3. 水凝胶生物墨水的制备

  1. 将 NaCl (0.45 g) 溶解于 50 mL 的 无菌水配制0.9% (w/v) NaCl溶液。振荡溶液以促进溶解。待完全溶解后，通过0.45 µm聚对苯二甲酸乙二醇酯滤膜过滤溶液。
  2. 称取低黏度海藻酸钠粉末（1 g），溶于25 mL氯化钠溶液（步骤3.1）中，在60–80 °C高温条件下过夜搅拌，得到4%（w/v）的海藻酸钠储备液。该储备液可在4 °C保存1个月。
  3. 将海藻酸钠储备液（步骤 3.2）在烘箱中于 70 °C 加热 30 分钟，重复三次，以实现灭菌。
  4. 将适量的海藻酸钠储备液（步骤 3.3）用 0.9% NaCl 溶液（步骤 3.1）稀释，配制成浓度分别为 2%、1.5% 和 0.5% 的溶液 （质量体积比）
    注意：除了在烘箱中加热外，海藻酸钠溶液的其他制备步骤均应在通风橱内进行。
  5. 溶解1 g的 将明胶粉末溶于25 mL NaCl溶液（步骤3.1）中，在60–80 °C的高温下过夜，以制备4%（w/v）的明胶储备液。该储备液可在4 °C保存1个月。
  6. 将明胶储备液（步骤 3.5）在烘箱中于 70 °C 加热 30 分钟，重复三次，以实现灭菌。
  7. 将适量体积的明胶储备液（步骤 3.6）用 0.9% NaCl 溶液（步骤 3.1）稀释至终浓度为 1.5%（w/v）。
    注意：除了在烘箱中加热外，明胶溶液的其他制备步骤均应在通风橱内进行。
  8. 为促进细胞在微载体上的黏附，将2% (w/v)海藻酸钠溶液与鼠尾I型胶原溶液（4 mg/mL）按3:1的比例混合，配制海藻酸钠-胶原溶液。用0.1 M NaOH溶液调节溶液pH至7.2后使用 制备后立即使用。
  9. 将酪氨酸修饰的透明质酸絮状固体溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，在60–80 °C下过夜搅拌，得到0.8%（w/w）的酪氨酸修饰透明质酸PBS溶液。该储备溶液可在4 °C下保存1个月。
  10. 将酪氨酸修饰的透明质酸PBS溶液在烘箱中于70 °C加热30分钟，重复三次以进行灭菌。
  11. 将辣根过氧化物酶粉末（500 酶活性单位/mg）溶于 PBS 溶液中，配制成 8 酶活性单位/mg 的辣根过氧化物酶 PBS 溶液。
  12. 将30%（w/w）的过氧化氢溶液用去离子水稀释至4 mM。
  13. 通过将酪氨酸修饰的透明质酸PBS溶液与辣根过氧化物酶PBS溶液按1:1的比例混合，制备改性的HA-辣根过氧化物酶溶液。
    ​注意：除在烘箱中加热外，HA-辣根过氧化物酶溶液的其他制备步骤均应在通风橱内进行。

4. 基于AVIFJ的微液滴生成

  1. 使用先前报道的自制细胞打印系统（图1A）26。波形发生器输出的电信号首先被放大，然后驱动压电陶瓷产生可控形变。固定在压电陶瓷上的喷嘴因此产生可控振动。
  2. 用75%（v/v）酒精擦拭并经紫外（UV）照射过夜，对打印系统进行灭菌。
  3. 将5 mL生物墨水（步骤3.1）装入一次性无菌注射器中，并将注射器安装到注射泵上。
  4. 使用内径为1 mm的硅胶管将注射器（步骤4.3）与喷嘴（步骤2.5）连接。
  5. 通过调节夹紧螺钉的松紧度，固定用于打印的喷嘴（步骤4.4）。安装时保持喷嘴尖端远离基底，以避免损坏和污染。
    ​注意：若在安装过程中喷嘴破裂，请佩戴较厚的手套，并仔细清理玻璃碎片和残留物。
  6. 快速推动注射泵，将生物墨水（步骤4.3）加载至喷嘴（步骤4.5），设置流速为30 µL/min。擦去喷嘴尖端多余的材料。
  7. 设置信号发生器参数。导入自行设计的包含500,000个采样点的波形，采样率和峰峰值电压（Vpp）分别设为5百万样本/秒和10 V。
  8. 用去离子水清洗载玻片或培养皿，并将其置于喷嘴下方作为打印基底。
  9. 预设运动路径，并将振动触发模式设为按需喷滴（drop-on-demand）。
  10. 按照预先设计的图案打印液滴。

5. 基于AVIFJ的微载体形成

  1. 重复步骤 4.1–4.4，但更换生物墨水 至2% (w/v)海藻酸钠溶液（步骤3.4）、海藻酸钠-胶原蛋白溶液（步骤3.8）或改良的透明质酸-辣根过氧化物酶溶液（步骤3.13）。
  2. 将3 g氯化钙溶解于100 mL水中 无菌水配制3%（w/v）氯化钙溶液。待完全溶解后，通过0.45 µm聚对苯二甲酸乙二醇酯滤膜过滤溶液。
  3. 加入5 mL的 交联溶液（氯化钙溶液或过氧化氢溶液）加入培养皿中。将培养皿置于喷嘴下方作为基底。
  4. 打印后，将微载体交联 3 分钟。
  5. 收集微载体悬浮液至离心管中，通过29 × g离心富集微载体 g 孵育3分钟。将微载体重悬于培养基中，浓度约为600个微载体/毫升。

6. 在微载体表面接种细胞

  1. 用Cell Tracker Green CMFDA对A549细胞进行染色，以方便观察细胞。具体操作为：移除培养基，加入5 mL的 在培养箱中，用含有10 µM Cell Tracker染料的无血清培养基孵育细胞30分钟。随后，更换为新鲜培养基。
  2. 以 1.6 × 10⁶ 个细胞/mL 的密度重悬 A549 细胞悬液6 cells/mL
  3. 将1 mL海藻酸盐-胶原蛋白微载体悬液（步骤5.3）和1 mL A549细胞悬液（步骤6.1）加入低吸附6孔培养板中。
  4. 将培养板置于摇床中，37 °C、5% CO₂ 培养箱内以 30 rpm 振荡培养2.
  5. 从摇床取下培养板，静置30分钟使微载体沉降。每2天更换一半培养基。

7. 微滴/微载体形成的分析

  1. 在明场显微镜或共聚焦显微镜下观察并测量喷嘴（步骤 2.2）、培养皿（步骤 4.10 和步骤 5.4）以及带有微载体的细胞（步骤 6.5）。具体而言，物镜放大倍数为 4x、10x 或 20x，目镜放大倍数为 10x。
  2. 使用 ImageJ 软件测量微载体的直径。根据显微镜拍摄图像时附带的比例尺，在 ImageJ 中设定比例尺的实际尺寸，并绘制 10 条微载体的半径或半长轴线段。ImageJ 可计算出这些线段的平均长度及标准差。

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结果

制造了具有不同会聚速率和直径的打印头，以实现多种材料的打印。随着拉伸强度增加而获得的喷嘴如图所示 图1B喷嘴被分为三个区域：储液区（III）、收缩区（II）和喷头区（I）。储液区为喷嘴未加工部分，用于提供液体静压及生物墨水的输入。收缩区是产生向下驱动力的主要区域。拉力强度对喷头区有显著影响，拉力越长，收敛速率越低。喷头区越窄且越长，打印过程中的表面张力越大，导致离散微液滴的形成更加困难，但有利于后续操作中切割出更小直径的喷头尖端。随后，使用针头锻造仪器在指定直径处截断喷头图1C）。具有不同直径的吸头，包括 100、120、150 和 200 µm，可用于制备不同尺寸的微载体，满足不同应用的需求 体外 微组织

首先通过在培养皿上打印液滴来验证打印过程的稳定性和可控性。使用30 µm尖端喷嘴，多种生物墨水（包括PBS、1.5%海藻酸钠和1.5%明胶）均实现了稳定打印（图2A，...

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讨论

本文所述方案提供了多种水凝胶微载体的制备方法及后续细胞接种的操作指导。与微流控芯片和喷墨打印方法相比，AVIFJ法在构建微载体方面具有更高的灵活性和生物相容性。该方法采用独立喷嘴设计，可兼容多种轻质喷头，包括玻璃微量移液管，适用于此类打印系统。其高度可控的加工过程允许自由调节包括储液腔体积、喷头内径和喷头形状在内的各项参数。此外，一次性喷嘴便于在不同材料之间切换时进行灭菌处理，避免因重复使用可能带来的污染风险。最后，在打印过程中，仅对喷嘴施加微小且快速的位移，而非强烈的力或热条件，从而最大程度地保持了所打印生物墨水原有的物理和化学特性；这一特点在生物材料应用中具有显著优势。

成功制备合适尺寸微载体最关键的步骤是：1）准备具有适当直径尖端的喷嘴，以及2）根据所打印生物墨水的黏度调整合适的采样频率和Vpp。通过去除卫星液滴并施加外部驱动力，可进一步实现微载体构建的稳定性。增加参数有助于微载体的形成，但过强的驱动力是产生卫星微载体的主要原因，会导致微载体尺寸不均一。因此，为提高微载体尺寸的均匀性，建议采用适当（而非过强）的采样频率和Vpp。提高微载体稳定性的另一个方面是施加外部驱动力。外...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了北京市自然科学基金（3212007）、清华大学自主科研计划项目（20197050024）、清华大学春风基金（20201080760）、国家自然科学基金（51805294）、国家重点研发计划（2018YFA0703004）以及“111 计划”（B17026）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A549 细胞ATCCCCL-185人非小细胞肺癌细胞系
明场显微镜OlympusDP70
共聚焦显微镜NikonTI-FL
胎牛血清，FBSBI04-001-1ACS
明胶SIGMAG1890
玻璃移液管sutter instrumentb150-110-10
GlutaMAXGIBCO35050-061
H-DMEMGIBCO11960-044杜氏改良伊格尔培养基
辣根过氧化物酶粉末SIGMAP6782
疏水剂3MPN7026按照生产商说明稀释后使用
微电极拉制仪narishigeMF-900
非必需氨基酸，NEAAGIBCO11140-050非必需氨基酸
青霉素 G 和链霉素GIBCO15140-122
培养皿SIGMAP5731-500EA
拉针仪sutter instrumentP-1000
海藻酸钠SIGMAA0682
胰蛋白酶GIBCO25200-056
大鼠尾Ⅰ型胶原溶液SIGMAC3867

参考文献

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