本方案详细介绍了使用特殊静脉导管、标准化的一次性无菌管路、结合实时监测的温度控制以及报警系统，进行两步胶原酶灌注，以提高分离的原代大鼠肝细胞的活力、得率和功能的一致性。
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本文内容
摘要
摘要
原代肝细胞被广泛应用于肝脏疾病的基础研究以及体外毒性检测。in vitro 原代肝细胞分离的两步胶原酶灌注法在技术上具有挑战性，尤其是在门静脉插管环节。此外，由于灌注装置的组装、优化或维护存在困难，该过程还容易出现偶然污染以及灌注条件的波动。本文介绍了一种经过改进的、具备多参数灌注控制的两步胶原酶灌注法的详细操作流程。通过在关键步骤采取必要的技术措施，并采用特殊的静脉留置针、标准化的一次性无菌管路、温度控制以及实时监测与报警系统，显著降低了操作难度并减少了灌注参数的变异性，从而实现了大鼠原代肝细胞的高效且稳定的分离。所获得的原代大鼠肝细胞 consistently 具有较高的细胞活力（85%–95%）、得率（每只200–300 g大鼠可获得2–5 × 108 个细胞）以及功能活性（白蛋白、尿素及CYP酶活性）。该方法配套使用了一套集成化灌注系统，结构紧凑，可在超净工作台内完成安装，确保无菌操作。
引言
原代肝细胞是肝脏相关基础研究、疾病治疗及药物测试等应用的重要工具。目前，原代肝细胞分离的金标准方法是两步胶原酶灌注法。1,2,3 由Seglen在20世纪70年代提出4然而，该操作在技术上具有较高难度，初学者外科医生进行时失败率较高。即使灌注被认为成功，肝细胞的活力（通常为60%–95%）和产量（0.5–5 × 108 在不同分离过程中，每200–300 g大鼠的肝细胞产量可能存在差异，这会影响后续实验的质量和规模。除技术操作外，用于分离的灌注装置（无论是商业产品还是自行组装）也是影响因素之一。必须重视灌注装置的组装、优化和维护。本方案的目的是通过对两步胶原酶灌注法的技术操作和灌注装置进行多参数灌注控制，提高原代大鼠肝细胞分离的成功率和实验间稳定性。
从技术角度来看，该操作过程中最困难的步骤是门静脉插管。至于其他步骤，只要遵循良好的操作规范并采取常规预防措施，即可提高分离的稳定性。因此，理解每一步骤的原理至关重要，以便术者能够应对操作过程中可能出现的各种变量。
已有多种关于从大鼠和小鼠中分离肝细胞及肝脏非实质细胞的实验方案发表1
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方案
所有实验操作及动物饲养均按照新加坡国立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的要求，在协议编号 R15-0027 和 R19-0669 下进行。
1. 溶液和手术器械的准备
- 使用超纯水配制 表1 中的缓冲液和细胞培养基。
- 使用前将无钙缓冲液和胶原酶缓冲液在水浴中预热至 37 °C。
- 对以下手术器械和实验设备进行高压灭菌：一对尖钝型手术剪、一对钝-钝型手术剪、一对弯型手术剪、两对齿状组织镊、两对弯型镊子、两个血管夹、一段长 5 cm 的 3-0 丝线手术缝合线、一个 100 µm 尼龙网筛、一个 400 mL 烧杯以及一个载物台（漂浮式微量离心管架）。
2. 设置诱导多能干细胞（iPS）体系（见图1）
- 用70%乙醇擦拭超净工作台表面。用70%乙醇擦拭IPS，并将其移入超净工作台内。进行紫外灭菌处理，持续时间 >开启通风橱前15分钟。
警告：暴露于紫外光下可能导致眼睛疼痛和皮肤灼伤。开启紫外灯时，务必确保通风橱的挡板完全关闭。 - 将一套新的一次性管路组装到IPS上。将蠕动泵下游的管路用硅胶加热套包裹。在硅胶加热套下游的管路上安装灌注监测仪。
- 确保将两根管路入口的滚轴夹完全松开。将每....
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结果
外科医生可以通过观察某些步骤后的结果来判断肝脏灌注是否顺利进行。第一个结果可在插管、切断肝下腔静脉并恢复灌注流速后观察到。肝脏的颜色应已完全由深红色变为棕色，同时保持其体积不变。如果肝脏看起来略微塌陷，并带有红色色调或出现红色斑块，则表明灌注流速设置不当（过低），或门静脉插管不正确。如果肝脏不仅变为棕色，而且变得肿胀且僵硬，则表明灌注流速设置过高，或肝下腔静脉未被正确切断。如果仅有少数肝叶灌注不良，说明导管插入过深，仅灌注了门静脉的一个分支。第二个结果可在切除并夹闭肝下腔静脉后观察到。若肝上腔静脉的流出速度缓慢且微弱，可能意味着导管在切除过程中脱落，或肝下腔静脉未被妥善夹闭。第三个结果可在消化过程中观察到。在呈棕色的肝脏表面，应出现透明斑点或网状结构，并逐渐扩大。肝脏应失去原有的弹性，变得柔软且呈糊状。我们优化了胶原酶的浓度，以确保在12分钟内达到此状态。当试用新的一批胶原酶时，应延长消化时间，直至达到该状态为止。第四个结果可在肝细胞释放时观察到。当细胞被释放后，培养基应呈现浑浊外观。如果观察到大量颗粒状物质，则可能表明肝脏消化不充分。若消化完全，仅应残留白色网状血管结构。即使消化不完全(
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讨论
对于一般的两步胶原酶灌注操作，有几个要点需要特别注意。首先，在切除肝脏时必须格外小心，确保不损伤胃肠道，以免内容物泄漏导致细菌污染。此外，在动物手术过程中应避免损伤覆盖肝脏表面的格利森囊（Glisson's capsule）。如果撕裂过大，可能导致解离的肝细胞提前释放到胶原酶缓冲液中。其次，不同批次的胶原酶在消化肝脏组织的同时维持良好肝细胞活性的能力可能存在差异，因此每次使用新的胶原酶批次时都必须优化其用量5。建议在批量采购前先测试若干批次胶原酶，并选择效果最佳者。务必确保所用水为超纯水且pH值正确，水中杂质（如亚铁离子和铁离子）以及不正确的pH值可能影响胶原酶活性，从而显著影响所分离细胞的质量。尽管本方案中胶原酶缓冲液的循环使用是可选步骤，但并不推荐，因为所需胶原酶缓冲液的体积将增加至>400 mL。最后，灌注压力和流速应保持在适当范围内：过高的压力和流速会导致肝细胞死亡，而过低的压力和流速则会导致缓冲液无法充分流经较小的血管10。在无钙缓冲液灌注初期，压力会有所上升；但在转入胶原酶缓冲液灌注后，随着胶原酶对组织的消化作用降低了流动.......
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披露
周艳和余汉瑞声明存在利益冲突，因为他们持有Vasinfuse公司的股权，该公司生产并销售集成灌注系统。余汉瑞还持有Histoindex、Invitrocue、Osteopore、Pishon Biomedical、Ants Innovate和Synally Futuristech公司的股权，这些公司与本文所报告的信息不存在利益冲突。
致谢
本工作部分得到以下资助：新加坡教育部学术研究基金（MOE ARC，项目号 MOE2017-T2-1-149）；新加坡国立大学卫生系统创新种子基金 2017（NUHS Innovation Seed Grant 2017，项目号 NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02）；新加坡机械生物学研究所（R-714-106-004-135）；以及新加坡科技研究局（A*STAR）生物医学研究理事会下属生物工程与纳米技术研究所的资助（项目编号：IAF-PP H18/01/a0/014、IAF-PP H18/01/a0/K14 和 MedCaP-LOA-18-02），资助对象为 Hanry Yu。Ng Chan Way 为新加坡国立大学研究学者。谨此感谢共聚焦显微镜单元 &感谢新加坡国立大学流式细胞术单元在肝细胞纯度分析方面提供的帮助与建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料/设备 | |||
| 1 mL 注射器 | Nipro | ||
| 27G 针头 | Nipro | ||
| 黑色编织丝线，不可吸收、非无菌外科缝合线 | Look | SP117 | |
| Bochem 18/10 不锈钢镊子，尖端带弯曲圆头 | Bochem | 10333511 | |
| 一次性灌流装置 | Vasinfuse | BPF-112 | |
| 漂浮式圆形 1.5 mL 微量离心管架 | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| 德国标准组织镊，带齿 / 1×2 齿，14.5 cm | Walentech | ||
| Greiner Cellstar 吸液移液管 | Merck | GN710183 | |
| 血细胞计数板 | |||
| 集成灌流系统 | Vasinfuse | IPS-001 | |
| 弯头虹膜剪，不锈钢，11 cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
| 配备 10X 物镜的光学显微镜 | Olympus | ||
| 100µM 尼龙网片 | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| 手术剪，BL/BL，13 cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – BL/BL | |
| 手术剪，SH/BL，13 cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH/BL | |
| 反向止血夹 | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
| 水浴锅 | Grant | ||
| 试剂/化学品 | |||
| 10X 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | ||
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 137101 | |
| IV 型胶原酶 | Gibco | 17104019 | |
| 地塞米松 | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| 亚油酸 | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| I 型牛胶原蛋白 | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
| William’s E 培养基 | Sigma-Aldrich | W1878 |
参考文献
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917(2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endot....
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重印与许可
