Summary

عزل الخلايا الشحمية البنية من الأنسجة الدهنية البنية بين الكتفين لتحليل التعبير الجيني والبروتيني

Published: March 12, 2021
doi:

Summary

تصف هذه الدراسة طريقة جديدة لعزل الخلايا الشحمية البنية للفئران لتحليل التعبير الجيني والبروتيني.

Abstract

الأنسجة الدهنية البنية (BAT) هي المسؤولة عن توليد الحرارة غير المرتعش في الثدييات ، والخلايا الشحمية البنية (BAs) هي الوحدات الوظيفية ل BAT. بتحتوي هذه القطيرات على قطرات ليبيدات متعددة الأعراق وميتوكوندريا وفيرة، وتعبر عن فصل البروتين 1 (UCP1). يتم تصنيف BAs إلى نوعين فرعيين بناء على أصلها: BAs الكلاسيكية المشتقة من الجنين (cBAs) والخلايا الشحمية البيضاء المشتقة BAs. نظرا لكثافتها المنخفضة نسبيا ، لا يمكن عزل BAs عن BAT بطريقة الطرد المركزي التقليدية. في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة جديدة لعزل BAs من الفئران لتحليل التعبير الجيني والبروتيني. في هذا البروتوكول ، تم هضم BAT بين الكتفين من الفئران البالغة بمحلول Collagenase و Dispase ، وتم إثراء BAs المنفصلة بمحلول يوديكسانول 6٪. ثم تم تحليل BAs المعزولة باستخدام كاشف Trizol للعزل المتزامن للحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين. بعد عزل الحمض النووي الريبي ، تم استخدام المرحلة العضوية من المحللة لاستخراج البروتين. أظهرت بياناتنا أن محلول يوديكسانول 6٪ يثري BAs بكفاءة دون التدخل في دراسات التعبير الجيني والبروتيني المتابعة. عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF) هو عامل نمو ينظم نمو وتكاثر خلايا اللحمة المتوسطة. بالمقارنة مع الأنسجة الدهنية البنية ، كان لدى BAs المعزولة تعبير أعلى بكثير عن Pdgfa. باختصار ، توفر هذه الطريقة الجديدة منصة لدراسة بيولوجيا الخلايا الشحمية البنية على مستوى خلية واحدة.

Introduction

لدى كل من الفئران والبشر نوعان من الأنسجة الدهنية: الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) والأنسجة الدهنية البنية (BAT)1. يخزن WAT الطاقة في شكل دهون ثلاثية في الخلايا الشحمية البيضاء ، وتبدد الخلايا الشحمية البنية (BAs) من BAT الطاقة الكيميائية كحرارة2. بناء على أصلها التنموي ، يتم تصنيف BAs بشكل أكبر إلى BAs الكلاسيكية (cBAs) التي تشكلت أثناء نمو الجنين والخلايا الشحمية البيضاء المشتقة من BAs (خلايا بيج / برايت ، محولة من الخلايا الشحمية البيضاء في ظل ظروف الإجهاد)3. بتكون متعددة العينات، وتعبر عن البروتين الحراري الذي يفصل البروتين 1 (UCP1)4. يعد مستودع BAT بين الكتفين (iBAT) أحد مستودعات cBAs الأولية في الثدييات الصغيرة5 ، بينما تنتشر الخلايا البيج داخل WAT6.

نظرا لطبيعتها في تبديد الطاقة ، حظيت BAs باهتمام كبير كهدف علاجي للحد من السمنة7. لاستغلال BAs لغرض علاج السمنة ، من الضروري فهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في وظيفة BAs وبقائها وتجنيدها. الأنسجة الدهنية بما في ذلك BAT و WAT غير متجانسة. باستثناء الخلايا الشحمية ، تحتوي الأنسجة الدهنية على العديد من أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا البطانية والخلايا الجذعية الوسيطة والبلاعم8. على الرغم من توفر الأدوات الجينية لاستنفاد الجينات المرشحة على وجه التحديد في الفئران BAs ، مثل UCP1::Cre line9 ، فإن تقنيات تنقية BAs من BAT أو WAT محدودة ، مما يجعل من الصعب دراسة BAs على مستوى نوع الخلية الواحدة. بالإضافة إلى ذلك ، بدون الحصول على BAs خالصة ، لن يتم تحديد العلاقة بين BAs وغير BAs بوضوح. على سبيل المثال ، تم استخدام مستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية ألفا (PDGFRα) كعلامة لخلايا اللحمة المتوسطة غير المتمايزة ، ويتم التعبير عنها في الخلايا البطانية والخلالية ل BAT. في BAT المجهدة الباردة ، تؤدي الخلايا السلفية الإيجابية PDGFRα إلى ظهور BAs10 جديدة. يتم تنشيط PDGFRα بواسطة ليجند PDGF ، وهو عامل نمو ينظم نمو وتكاثر خلايا اللحمة المتوسطة11 ؛ ومع ذلك ، فمن غير الواضح ما إذا كانت BAs تؤثر على سلوك الخلايا السلفية الإيجابية PDGFRα عن طريق إفراز PDGF.

في الآونة الأخيرة ، تم نشر بروتوكول عزل BAs ، والذي يعتمد على فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS)12. في هذا البروتوكول ، تم استخدام محلول ألبومين مصل البقر (BSA) بنسبة 3٪ لفصل BAs عن غير BAs ، وتم تنقية BAs المخصبة بواسطة FACS. وتطبيق هذا البروتوكول مقيد بمقتضيات عملية نظام مراقبة الأصول الميدانية، التي تعتمد على كل من المعدات وخبرات تشغيل نظام مراقبة الأصول الميدانية. في هذه الدراسة ، تم تطوير بروتوكول جديد لعزل BAs من BAT. يمكن استخدام BAs المعزولة بواسطة هذا البروتوكول مباشرة لدراسات التعبير الجيني والبروتيني. علاوة على ذلك ، تشير البيانات المستقاة من هذه الدراسة إلى أن BAs هي مورد PDGF رئيسي.

Protocol

تم الحفاظ على جميع الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض ، وتمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية للبحوث الطبية الماسونية (IACUC). UCP1::Cre9 و Rosa 26tdتم الإبلاغ عن خطوط الفئران13 سابقا. تم الاحتفاظ بجميع الفئران في درجة حرارة ا…

Representative Results

تحضير BAT بين الكتفين لعزل الخلايا الشحمية البنيةيوضح الشكل 1 أ عملية عزل الخلايا الشحمية البنية. ستستغرق العملية برمتها ، من إعداد BAT وحلول الهضم / الفصل إلى الحصول على BAs المعزولة حوالي 4 ساعات. في الفئران البالغة ، توجد BAT وفيرة في المنطقة بين الكت?…

Discussion

في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة جديدة لعزل BAs لتحليل التعبير الجيني والبروتيني.

في بروتوكول عزل BAs المنشور ، تم استخدام محلول BSA بنسبة 3٪ لإثراء BAs12. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام BAs المخصبة التي حققها هذا البروتوكول المنشور مباشرة لتحليل تعبير البروتين. وذلك لأن BSA الم…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم Z. Lin من قبل المعاهد الوطنية للصحة HL138454-01 وصناديق معهد البحوث الطبية الماسونية.

Materials

Antibodies
Antigen Company Catalog
PPARγ LSBio Ls-C368478
PDGFRa Santa Cruz sc-398206
UCP1 R&D system IC6158P
Chemical and solutions
Collagenase, Type II Thermo Fisher Scientific 17101015
1-Bromo-3-chloropropane Sigma-Aldrich B62404
Bovine Serum Albumin (BSA)  Goldbio A-421-10
Calcium chloride Bio Basic CT1330
Chloroform IBI Scientific IB05040
Dispase II, protease Sigma-Aldrich D5693
EDTA Bio Basic EB0107
Ethanol IBI Scientific IB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix LifeSct LS01131905Y
Magnesium Chloride Hexahydrate Boston BioProducts P-855
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix ABM G454
OptiPrep (Iodixanol) Cosmo Bio USA AXS-1114542
PBS (10x) Caisson Labs PBL07
PBS (1x) Caisson Labs PBL06
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227
Potassium Chloride Boston BioProducts P-1435
SimplyBlue safe Stain Invitrogen LC6060
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 75746
Trizol reagent Life technoologies 15596018
Primers
Gene name (Species)  Forward Reverse
Pdgfra (Mouse) CTCAGCTGTCTCCTCACAgG CAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mouse) TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG TTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse) TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC TCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1 ACTGCCACACCTCCAGTCATT CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Equipment
Name Company Application
Keyence BZ-X700 Keyence Imaging brown adipocytes
Magnetic stirrer VWR Dissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System Applied Biosystem Quantitative PCR
The Odyssey Fc Imaging system LI-COR Western blot immaging

References

  1. Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
  2. Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, 305763 (2013).
  3. Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
  4. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  5. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
  6. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
  7. Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
  8. Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  9. Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
  10. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
  11. Kim, W. -. S., Park, H. -. S., Sung, J. -. H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
  12. Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
  13. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
  14. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  15. Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
  16. Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
  17. Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
  18. Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
  19. Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
  20. Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
  21. Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).

Play Video

Cite This Article
Negron, S. G., Xu, B., Lin, Z. Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis. J. Vis. Exp. (169), e62332, doi:10.3791/62332 (2021).

View Video