Method Article

ApoE小鼠后肢缺血的改进手术模型-/- 使用微型切口

DOI:

10.3791/62402

⸱

May 13th, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical Faculty Manheim, Heidelberg University, 2European Center of Angioscience ECAS, Medical Faculty Manheim, Heidelberg University, 3Computer-Assisted Clinical Medicine, Mannheim Institute for Intelligent Systems in Medicine, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Cooperative Core Facility Animal Scanner ZI, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

In This Article

Summary

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本文展示了一种有效的手术方法，用于通过小切口在小鼠中建立急性缺血。大多数研究小组都可以应用这种方法，而无需任何实验室升级。

Abstract

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本研究的目的是介绍和评估一种改进的手术方法，以诱导小鼠急性缺血，该方法可以在大多数动物实验室中实施。与传统的股动脉双结扎（DLFA）方法相反，在右侧腹股沟区域做了一个较小的切口，以暴露股骨近端动脉（FA）以执行DLFA。然后，使用7-0缝合线，将切口拖到膝盖区域以暴露远端FA.使用双侧后肢的磁共振成像（MRI）来检测手术后的FA闭塞。在手术后0，1，3，5和7天，使用Tarlov量表对后肢的功能恢复进行视觉评估和分级。在DLFA后7天对动物实施安乐死后进行组织学评估。在十只ApoE-/- 小鼠的右腿上成功进行了手术，在随后的观察中没有小鼠死亡。所有10只小鼠的切口大小小于5毫米（4.2±0.63毫米）。MRI结果显示缺血侧的FA血流明显受阻。Tarlov量表结果显示，术后后肢功能显著下降，并在接下来的7天内缓慢恢复。组织学评估显示缺血侧有明显的炎症反应，缺血性后肢微血管密度降低。总之，本研究引入了一种使用微型切口的改良技术，以使用DLFA进行后肢缺血（HLI）。

Introduction

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对于外周动脉疾病（PAD）等血管疾病的研究，临床前动物模型的需求尚未得到满足。尽管在诊断和治疗方面取得了先进的发展，但在2018年有超过2亿名PAD患者1，并且他们的人数还在不断增加。虽然已经描述了几种新的治疗方法2，3，4，5，6，7，但将这些治疗方式成功转化为临床应用仍然是一项艰巨的任务。因此，需要可靠且相关的体内实验模型来模拟人类疾病状况，以研究这些治疗PAD6，7的新治疗方法的潜在机制和效率。

高脂血症和动脉粥样硬化（AS）是PAD发展的主要危险因素。ApoE-/-小鼠（高脂肪饮食）表现出异常的脂肪代谢和高脂血症，随后发展出动脉粥样硬化斑块，使ApoE-/-小鼠成为模拟临床相关PAD的最佳选择。临床前HLI动物模型是通过股动脉双结扎（DLFA）生成的，这....

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Protocol

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注意:所有实验程序均根据EC指南EC 2010/63 / EU进行，并已获得德国当地立法（35-9185.81 / G[1]239 / 18）的批准。10只具有C57BL / 6J背景的雄性ApoE-/- 小鼠，重29.6-38.0g，在12小时的光/暗循环中饲养，并从8周龄开始随意喂食西方饮食（1.25%胆固醇和21%脂肪）和 随意 浇水12周。如下所述，在20周龄的小鼠上进行HLI。

1.在ApoE-/- 小鼠中诱导HLI

  1. 准备手术所需的设备和工具（见 材料表 和 图1）。使用前通过高压灭菌对手术器械进行灭菌，并在手术过程中使用玻璃珠灭菌器。
  2. 在所有外科手术之前，皮下注射（S.C）咪达唑仑（5mg / kg），美托咪定（0.05mg / ml / kg）和芬太尼（0.5mg / kg）混合物麻醉小鼠。
    1. 麻醉开始后，在眼睛上使用兽医软膏以防止干燥，并确认前肢和后肢没有踏板退出反射。
  3. 然后将鼠标放在加热垫上，将核心体温保持在约37°C。 使用棉签和脱毛膏，小心地从右侧的后肢皮肤上去除毛发。
    注意:脱毛霜的使用量应足以覆盖后肢，特别是将要做切口的腹股沟区域。脱毛霜的使用时间应少于3分钟，随后应用湿润的棉签取出2至3次。....

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Results

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ApoE-/-小鼠的特征
DLFA手术成功在10只小鼠身上进行，以建立HLI模型，手术后没有一只小鼠死亡。为了跟踪体重的变化，在DLFA手术（Pre-DLFA）和DLFA手术后7天（DLFA后）对小鼠进行称重。DLFA之前的权重范围为29.6至38.0克（平均34.74±2.47克），DLFA后的重量范围为26.5至34.1克（平均30.77±2.15克），明显低于DLFA之前的重量（P <0.05， 图3A）。手术时间从15分钟到47分钟不等（平均34.2±8.82分钟，不包括麻醉时间）。10只小鼠的切口大小范围为3至5毫米（平均4.2±0.63毫米）。

磁共振成像扫描和功能恢复
MRI扫描非常清楚地表明，右FA的近端和远端区域没有显示灌注（图3C），表明该方法的成功。术.......

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Discussion

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本研究报告了一种经过修改，简化且手术有效的方法，可在ApoE-/-小鼠中建立HLI模型，通过3-4mm切口在FA的近端和远端区域进行双连接，而无需任何实验室升级。与先前报道的小鼠HLI模型8，9，10，11，12，15，20，22，23，24的研究相比，该方法的主要特征是切口的尺寸更小。

从历史.......

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Disclosures

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作者声明，文章内容是在没有任何商业或财务关系的情况下撰写的，这些关系可以被解释为潜在的利益冲突。

Acknowledgements

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作者感谢Viktoria Skude，Alexander Schlund和Felix Hörner的出色技术支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x 磷酸盐缓冲盐水Roth9143.1用于苏木精和伊红染色和免疫组织化学染色
30% H2O<>2Roth9681.2用于免疫组织化学染色
6-0 可吸收缝合线PROLENE8776H用于缝合皮肤
6-0 吸收缝合线PROLENEEP8706用于手术
7-0 可吸收缝合线PROLENEEH8021E用于结扎动脉
7-0 可吸收缝合线PROLENEEP8755用于手术
醋酸Roth6755.1用于苏木精和伊红染色
白蛋白碎片 VRoth8076.2用于免疫组织化学染色
高压灭菌器Systec GmbHSystec VX-150用于手术器械的消毒
Axio vert A1 显微镜Carl ZeissZEISS Axio Vert.A1用于查看和拍摄苏木精和伊红染色以及免疫组织化学染色
Bruker BioSpec 94/20 AVIIIBruker Biospin MRI GmbHN/A扫描股动脉阻塞
Buprenovet Sine 0.3mg/mlBayer AG2542 （WDT）用于术后疼痛管理。剂量 - 手术后每 8 小时持续 48 小时 0.1 mg/kg 体重
CD31 抗体Abcamab28364用于免疫组织化学染色
曙红 Y 溶液 0.5 % 水溶液RothX883.1用于苏木精和伊红染色
表位修复溶液 pH 6Leica Biosystems6046945用于免疫组织化学染色
乙醇 ≥ 99,5 %Roth5054.1用于苏木精和伊红染色和免疫组化染色
芬太尼开曼化学437-38-7用于麻醉
细尖钳Medixplus93-4505S用于分离动脉与神经和静脉
玻璃珠消毒器Simon Keller250 型手术器械的消毒
Graefe iris镊子弯曲VUBUVUBU-02-72207用于皮肤和皮下组织的钝
脱毛霜，Veet（含芦荟）Reckitt Benckiser108972从小鼠后肢去除毛发
加热板STÖRK-TRONIC7042092保持小鼠的稳定温度
苏木精RothT865.2用于苏木精和伊红染色和免疫组化染色
徕卡手术显微镜LeicaM651扩大视野以方便作
液体 DAB+底物显色系统DakoK3468用于免疫组化染色
雄性 ApoE-/- 小鼠Charles River LaboratoriesN/A用于建立外周动脉疾病小鼠模型
美托咪定开曼化学128366-50-7用于麻醉
微针架黑色 &Black SurgicalB3B-18-8握针
微型缝合打结钳Life Saver Surgical IndustriesPS-MSF-145用于手术过程中协助打结
切片机生物碱Bk-MT268m用于组织切片
咪达唑仑Ratiopharm44856.01.00用于麻醉
MR 兼容的小动物监测和门控系统1025 型SA InstrumentsN/a在 MRI 扫描期间监测动物的生命体征
Octeniderm farblosSchüLKE 和Mayr GmbH180212用于皮肤消毒
和鼻子软膏Bayer AG1578675在麻醉下保持眼睛湿
多聚甲醛Roth0335.1用于固定组织
戊巴比妥Nembutal76-74-4用于麻醉
生理盐水DeltaSelect1299.99.99用于麻醉
弹簧手柄剪刀，尖端细腻黑色 &黑色外科手术B66167用于切割动脉
SuperCut 剪刀黑色 &黑色外科B55992用于切割皮肤
Triton X-100Roth9002-93-1用于免疫组织化学染色
西方饮食，1.25% 胆固醇ssniff Spezialdiäten GmbHE15723-34小鼠饮食
二甲苯Roth4436.3用于苏木精和伊红染色和免疫组织化学染色
用于分离 眼睛润

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shu, J., Santulli, G. Update on peripheral artery disease: Epidemiology and evidence-based facts. Atherosclerosis. 275, 379-381 (2018).
  2. Tateishi-Yuyama, E., et al. Therapeutic ....

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