HiBiT 기반 바이오 리포터를 사용하여 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 항체 검출
Summary
설명된 프로토콜은 HiBiT 수용체 결합 도메인 단백질 복합체를 생성하고 SARS-CoV-2 항체의 빠르고 민감한 검출을 위한 그것의 응용을 생성하기 위한 절차를 기술합니다.
Abstract
COVID-19 전염병의 출현은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)의 역학적 영향을 결정하기 위해 더 나은 혈청 학적 검출 방법의 필요성을 증가시켰습니다. SARS-CoV-2 감염의 증가 수는 더 나은 항체 탐지 소의를 위한 필요를 제기합니다. 현재 항체 검출 방법은 속도에 대한 감도를 손상시키거나 민감하지만 시간이 많이 걸립니다. SARS-CoV-2 중화 항체의 큰 비율은 SARS-CoV-2의 1차 면역원체 구획 중 하나인 수용체 결합 도메인(RBD)을 표적으로 한다. 우리는 최근에 SARS-CoV-2 항체를 검출하기 위하여 고과민한 생물 발광 태그 RBD (NanoLuc HiBiT-RBD)를 설계하고 개발했습니다. 다음 텍스트는 HiBiT-RBD 복합체를 생성하는 절차와 이 도구를 사용하여 RBD 표적화 항체의 존재를 평가하는 빠른 분석방법을 설명합니다. HiBiT-RBD 단백질 생성물의 내구성과 1시간 이내에 완료할 수 있는 실험 절차가 짧기 때문에, 이 프로토콜은 환자 혈청 시료에서 SARS-CoV-2 항체를 검출하는 보다 효율적인 대안으로 간주될 수 있다.
Introduction
새로운 코로나바이러스, SARS-CoV21의 최근 출현은 20212년 3월 30일 현재 2,800,000명 이상의 사망자와 1억 2,800만 건의 감염을 일으켰습니다. SARS-CoV-2 임상 치료에 대한 신뢰할 수 있고 잘 확립된 치료 절차의 부족으로 인해, 효과적이고 강력한 치료 또는 백신3을 개발하기 위해 더 많은 바이러스 전달및 더 중요한 것은 많은 노력을 하고있다. 현재까지 세계보건기구(WHO4)가 보고한 임상시험에서 50명 이상의 COVID-19 백신 후보가 있습니다. SARS-CoV-2에 대하여 항체의 검출은 COVID-195의 복구한 환자에서 뿐만 아니라 백신의 행정에 유머 반응의 장기적인 안정성을 결정하는 것이 가장 중요합니다. 일부 연구는 SARS-CoV-2 환자가 1 년 5,6,7,8,9 후에 RBD 결합 항체의 대부분을 분실할 가능성이 있다는 것을 보여주었습니다. 지속적인 면역을 더 잘 이해하기 위해서는 추가 조사가 필요하며, 보다 민감한 항체 검출 플랫폼은 그러한 작업을 더 많이 도울 수 있습니다. 장기 항체 반응을 건의하는 온화한 SARS-CoV-2 감염의 지속적인 면제의 보고는 또한 연구 결과의 흥미롭고 가치 있는 지역입니다. 빠르고 정확한 검출 방법은 개체의 세라에서 항체를 모니터링하여 인구 내 면역에 대한 자세한 정보를 제공하는 데 필수적입니다.
다른 코로나바이러스와 마찬가지로 SARS-CoV-2는 튀어나온 스파이크 당단백질을 사용하여 안지오텐신 변환 효소-2(ACE2)에 결합하여 바이러스 및 세포막6,7의 융합으로 이어지는 일련의 이벤트를 시작합니다. 몇몇 연구 결과는 최근에 SARS-CoV28,9,10,11에 대하여 강력하고 특정 항체 반응을 유도에 있는 중요한 역할을 하는 스파이크 단백질의 RBD를 증명했습니다. 특히, Premkumar 외에서 관찰된 상관관계는 RBD 결합 항체와 SARS-CoV-2 중화 능력 사이의 환자 혈장의 면역원성 구획인 RBD와 일치한다9. 이를 염두에 두고 SARS-CoV-2 항체 검출에 사용할 수 있는 많은 진단 테스트는 시간과 비용 집약적이며, 인큐베이션 및 세척의 긴 절차가 필요하거나(효소 연계 면역 소르벤트 분석[ELISA]), 또는 감도 및 정확도 부족(측면 흐름 면역분석술[LFIA])12. 따라서, 고감도, 빠른 반응 및 상대적으로 낮은 비용으로 COVID-19 유래 항체 검출의 정량적이고 신속한 상보적 세로로지컬 방법은 SARS-CoV-2 역학 감시를 위한 신뢰할 수 있는 혈청학적 검사의 필요성을 제공할 것이다.
총체적으로, 현재 의 혈청 분석의 한계는 미래 혈청 조사에서 잠재적인 진단 에이전트로 생물 발광 보고 시스템의 조사를 자극했습니다. 생물 발광은 광 방출과 함께 자연적으로 발생하는 효소 / 기질 반응입니다. 나노루크 루시파라제는 가장 작은(19kDa)이지만 레닐라와 반딧불 루시파라제(각각 36kDa, 61kDa)에 비해 가장 밝은 시스템입니다.13,14. 또한, Nanoluc는 이전에 언급 된 시스템 중 노이즈 비율및 안정성에 가장 높은 신호가 있습니다. Nanoluc의 높은 신호 강도는 매우 낮은 양의 리포터 fusions15의 검출을 지원합니다. 나노 루크 바이너리 기술 (나노 BiT)는 나노 루크 시스템의 분할 버전입니다, 이는 두 부분으로 구성되어 있습니다: 작은 BiT (11 아미노산; SmBiT) 및 상대적으로 낮은 친화성 상호 작용 (KD = 190 μM)를 가진 대형 BiT (LgBiT)는 발광 복합체를 형성한다16. NanoBiT는 단백질-단백질 상호 작용15,17,18,19 및 세포 신호 경로11,20,21의 식별을 포함하는 다양한 연구에서 광범위하게 사용됩니다.
최근에는 SmBiT 대신 HiBiT 나노 글로 시스템, 즉 LgBiT(KD = 0.7 nM)에 명백히 높은 친화력을 가진 또 다른 소형 펩타이드가 도입되었다. 나노 글로의 높은 친화력과 강한 신호 “추가 혼합 읽기” 분석으로 HiBiT는 적합하고 정량적이며 발광 펩타이드 태그가 됩니다. 이러한 접근법에서 HiBiT 태그는 최소한의 구조적 간섭을 부과하는 구조를 개발하여 표적 단백질에 추가됩니다. HiBiT-protein fusion은 LgBiT 대응에 적극적으로 결합하여 검출 시약의 존재에서 검출 가능한 생체 발광을 생성하는 고활성 루시파아제 효소를 생성합니다(도 1). 유사하게, 우리는 SARS-CoV-2 회수 개인의 세라에서 중화 항체 티터를 쉽게 측정하는 HiBiT 나노 글로 계의 시스템을 개발하고 최근에 HiBiT 태그 SARS-CoV-2 RBD를 개발했다. 이 논문은 표준 실험실 절차 및 장비를 사용하여 HiBiT-RBD 바이오 리포터를 생산하기위한 프로토콜을 설명하고, 이 바이오 리포터가 SARS-CoV-2 RBD 표적화 항체를 검출하기 위해 빠르고 효율적인 분석에서 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
SARS-CoV-2에 감염된 사람들의 증가와 글로벌 예방 접종을 위한 지속적인 노력은 대규모 혈청 조사에서 사용될 수 있는 민감하고 빠른 혈청학 시험을 필요로 합니다. 최근 연구에 따르면 나노루시피파아제 계 바이오리포터를 분할하여 이러한 소사를 개발할 수 있습니다. 최근에는 HiBiT-RBD 바이오 리포터를 개발하여 빠르고 신뢰할 수 있는 방식으로 환자 혈청에서 SARS-CoV-2 특이적 항체를 검출하는 데 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 샤오홍 허, 리카르도 마리우스, 줄리아 페트리크, 브래들리 오스틴, 크리스티안 타네즈 데 수자의 기술 적 도움을 주셔서 감사합니다. 그래픽 디자인에 대한 미나 가레마니에게도 감사드립니다. 우리는 또한 이 연구 결과에 참가하고 그들의 혈액 견본을 기증한 모든 개별에게 감사하고 싶습니다. DWC는 uOttawa 학부 및 의학과에 의해 부분적으로 지원됩니다.
Materials
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga 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| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
References
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