用于追踪开放性眼球损伤及治疗效果的前房段器官培养平台

摘要

在农村或与军事相关的场景中，眼球开放性损伤可能数天内得不到治疗，从而导致失明。因此需要有效的治疗手段以最大限度减少视力丧失。本文详细介绍了一种眼球开放性损伤的器官培养模型。利用该模型，可对潜在的治疗药物在稳定此类损伤方面的效果进行科学评估。

摘要

眼球开放性损伤的视力预后较差，常导致永久性视力丧失。部分原因在于，在眼科医疗资源不易获得的农村环境和军事医学应用中，受伤与医疗干预之间存在较长时间的延误。当眼球失去其防水密封性后，未治疗的损伤容易发生感染，同时由于眼内低压导致组织活力丧失。如果能够合理开发出用于暂时封闭眼球开放性损伤的治疗手段，则有可能恢复眼内压并防止感染，直至获得适当的眼科治疗。为促进产品开发，本文详细介绍了使用前房器官培养开放性眼球损伤平台，以追踪损伤后至少72小时内的治疗效果。猪眼前段组织可在定制设计的器官培养皿中维持，并保持在生理眼内压水平。可通过气动系统制造穿通伤，该系统可产生直径最大达4.5 mm的损伤，与军事相关损伤尺寸相似。损伤后可连续观察72小时的眼内压下降情况，以确认损伤成功诱导及眼球防水屏障的丧失。在造成损伤后将治疗物施加于眼球表面，随后连续数天监测眼内压，即可评估其治疗效果。此外，眼前段损伤模型适用于多种广泛使用的方法，用于功能性及生物学层面监测眼前段生理状态，例如评估透明度、眼球力学性能、角膜上皮健康状况以及组织活力。总体而言，本文所述方法是迈向开发用于暂时封闭眼球开放性损伤的生物材料治疗手段的必要下一步，特别是在眼科医疗资源不易获得的情况下。

引言

开放性眼球（OG）损伤若在受伤后未得到及时治疗或至少稳定处理，可能导致永久性视力丧失¹。然而，在偏远地区，例如农村地区或军事作战场景的战场，由于难以及时获得眼科干预，延误治疗的情况十分普遍。当无法立即进行治疗时，目前的标准处理方法是使用硬质眼罩保护受伤眼，直至可实施医疗干预。在军事医学中，目前的延误时间最长可达24小时，但预计在未来城市环境的作战行动中，由于无法实施空中后送，这一时间可能延长至72小时^2,3,4。在眼科干预资源有限的偏远农村等民用场景中，延误时间可能更长^5,6。未治疗的OG损伤因眼球的密水结构遭到破坏，极易发生感染和眼内压（IOP）丧失^7,8。若伤后至治疗之间的延迟时间过长，IOP的丧失将影响眼内组织的存活能力，使任何医疗干预都难以恢复视力⁹。

为了推动开发易于应用的治疗手段，以在患者获得眼科专家救治前临时封闭眼球破裂伤（OG）创口，此前已建立了一种....

方案

在执行本方案之前，需注意有关在科研与培训中使用动物的法律和伦理要求。若使用活体动物获取眼组织，必须在开始前获得当地伦理或法律监管机构（如实验动物管理与使用委员会（IACUC）或伦理委员会等）的批准。若在获取动物使用许可方面存在任何疑问，不得继续进行。我们此前已确定并报道，死亡后24小时内获取并使用的新鲜猪眼在生理状态上最接近活体（in vivo）条件，适用于此类研究（Animal Technologies，Tyler，TX，USA）^10,13。本方案全程未使用活体动物，所有组织均通过组织供应商在动物死亡后24小时内获取。

注意：在组织到达之前，制备好器官培养皿（补充方案 1）、夹紧环（补充方案 1）、培养皿支架（补充方案 1）、压力传感器数据采集装置（补充方案 2）以及气动穿刺平台（补充方案 3）。对培养皿、工具和耗材进行灭菌，并准备操作区域。建议设置一个非无菌区域用于眼球的大体解剖，因为眼球通常带有附着的结缔组织和眶周组织。这些初步步骤应在开放的洁净工作台面上进行，随后将眼球无菌转移至生物安全柜 II 级（BSC II）中进行显微解剖（1 号柜）。理想情况下，用于显微解剖的....

结果

通过光学相干断层扫描（OCT）捕获的图像展示了视神经夹伤（OG）损伤眼的典型表现，以说明成功诱导损伤的形态特征。图3展示了对照组和OG损伤眼前段组织在损伤后即刻以及72小时后的图像。图像包含两种视图：穿过损伤部位的横截面图像，以及用于显示图像表面区域的最大强度投影（MIPs）俯视图。对照组眼睛的角膜未见明显结构紊乱，而OG损伤后可清晰观察到贯穿整个角膜的损伤区域。从MIPs图像可见，损伤区域的形状和大小不规则，但损伤范围在72小时内有所缩小。此前研究表明，该变化在多种测试的损伤尺寸中均具有显著性¹³。

本方案所述 OG 损伤模型的主要数据输出为实验过程中眼内压的变化。数据以毫伏为单位记录，来源于各压力传感器的输出，可通过校准转换为 mmHg（补充方案 4）。文中提供了符合使用标准和不符合使用标准的眼内压随实验时间变化的示例数据（图 4A）。根据压力轨迹数据，眼睛在培养 24 小时后连.......

讨论

在使用ASOC OG损伤平台时，有几个关键步骤需要特别强调，以提高采用该方法时的成功率。首先，在前房解剖过程中，保留小梁网至关重要，但正确操作具有挑战性。如果小梁网遭到破坏，眼球将无法维持生理眼压，因而不符合实验使用标准。建议先在常规条件下练习解剖过程，待掌握正确的解剖技术后再引入额外的无菌操作要求。其次，在将眼球安置于ASOC培养皿中时，必须确保固定程度适中：既要足够紧密以防止液体泄漏，又要避免过紧而损坏ASOC培养皿。若眼球固定不牢，液体会通过非生理途径渗出，导致眼内压（IOP）极低甚至无法检测。然而，用于固定眼球的夹紧环为塑料材质，若过度拧紧则容易断裂。必须在两天内持续夹紧眼球，因为位于夹紧环下方的巩膜组织会在最初的24小时内发生压缩，导致组织松弛。建议在第1天拧紧夹环至感受到阻力为止，并在培养24小时后再次重新拧紧至相似程度，以获得最佳实验效果。

第三，在使用该模型时，必须充分了解流体流动在任何时候的流向。每个ASOC培养皿都连接了多个三通阀，用于引导来自注射泵或10 mL注射器储液器的液体流动，并连接至压力传感器。在不同的实验设置阶段，需要将阀门置于特定位置，以排出眼内气.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10-32 聚碳酸酯直插头，外螺纹管接头	McMaster-Carr	51525K431
10-32 沉头内六角螺钉，½"	McMaster-Carr	92196A269
10 mL 注射器	BD	302995
20 mL 注射器	BD	302830
Anti-Anti	Gibco	15240-096
球头L型内六角扳手	McMaster-Carr	5020A25
聚维酮碘	Fisher Scientific	NC1696484
BD Intramedic PE 160 管	Fisher Scientific	14-170-12E
棉签	Puritan	25-8061WC
DMEM 培养基	ATCC	30-2002
FBS	ATCC	30-2020
精细镊子	World Precision Instruments	15914
纱布	Covidien	8044
庆大霉素	Gibco	15710-064
Glutamax	Gibco	35050-061
高温硅胶O型圈，宽2 mm，内径4 mm	McMaster-Carr	5233T47
大型镊子	World Precision Instruments	500365
大型手术剪	World Precision Instruments	503261
中号带齿镊子	World Precision Instruments	501217
钉子（穿刺物）	McMaster-Carr	97808A503
尼龙注射器滤器	Fisher	09-719C
PBS	Gibco	10010-023
培养皿（100 mm）	Fisher	FB0875713
聚碳酸酯三通旋塞阀，带公 鲁尔 锁	Fisher	NC9593742
剃须刀片	Fisher	12-640
不锈钢18 G 90度 角分配针头	McMaster-Carr	75165A81
不锈钢18 G 直型 ½'’ 分配针头	McMaster-Carr	75165A675
带盖无菌100 mL 烧杯	VWR	15704-092
Vannas 剪刀	World Precision Instruments	WP5070