体内 皮肤树突状细胞差异亚群在皮下白色 念珠菌 感染中诱导 Th17 免疫的功能

Summary

在这里，我们展示了皮肤树突状细胞亚群在深部真皮念珠菌白色念珠菌感染的 Th17 免疫中的体内功能。

Abstract

皮肤是人体最外层的屏障器官，它包含几种类型的树突状细胞 （DC），这是一组专业的抗原呈递细胞。当皮肤遇到入侵的病原体时，不同的皮肤 DC 会启动独特的 T 细胞免疫反应以保护身体。在入侵的病原体中，真菌感染特异性地驱动产生保护性白细胞介素 17 的 Th17 免疫反应。开发了一种方案，通过皮内白色 念珠菌 感染有效区分 Th17 细胞，以研究负责诱导 Th17 免疫的皮肤 DC 亚群。流式细胞术和基因表达分析显示，Th17 免疫反应在皮肤引流淋巴结和感染皮肤中显著诱导。使用白喉毒素诱导的 DC 亚群耗竭小鼠品系，发现 CD301b⁺ 真皮 DC 负责在该模型中实现最佳 Th17 分化。因此，该方案提供了一种有价值的方法来研究皮肤 DC 差异子集的 体内 功能，以确定 Th17 对深层皮肤真菌感染的免疫力。

Introduction

皮肤是最外层的屏障器官，它保护身体免受外部病原体和刺激的侵入¹。皮肤由两个不同的层组成，包括表皮 - 角质形成细胞的分层上皮 - 和下面的真皮 - 胶原蛋白和其他结构成分的致密网络。作为主要的上皮屏障组织，皮肤主要提供物理屏障，并有助于额外的免疫屏障，因为它包含许多常驻免疫细胞 ^2,3。在皮肤免疫细胞中，树突状细胞 （DC） 是一种专业的抗原呈递细胞，根据抗原的性质，主动摄取自身和非自身抗原并迁移到区域淋巴结 （LNs），以启动抗原特异性 T 细胞反应和耐受性⁴。

皮肤含有表皮抗原呈递细胞，即朗格汉斯细胞 （LC） 和至少两种类型的 DC，包括 1 型真皮常规 DC （cDC1） 和真皮 2 型常规 DC （cDC2）⁵。表皮 LC 起源于胚胎单核细胞，在稳态条件下通过自我延续来维持其细胞数量⁶。相比之下，真皮 cDC1 和 cDC2 来源于造血干细胞，并由 DC 定型祖细胞持续补充⁵。皮肤 DC 以其表面标志物为特征，大致分为 Langerin^+....

Protocol

注意:所有动物实验均已获得机构动物护理和使用委员会（IACUC，批准 ID:2019-0056、2019-0055）的批准。本研究使用体重 18-24 g 的 7 至 9 周龄野生型 （WT） C57BL/6 雌性小鼠。一些研究是使用相同年龄和体重的雌性 Langerin-Diphtheria toxin receptor （DTR） 和 CD301b-DTR 小鼠进行的。每组使用 4 到 6 只小鼠进行实验，数据代表三个独立实验。这项工作是在生物安全 3 级条件下进行的，也可以根据机构指南（室温 23 °C ± 3 °C，湿度 50% ± 10%）在 2 级生物安全条件下进行。

1. 白色念珠菌的制备

注意:本节中的实验是在生物安全柜中进行的。

1. 使用接种环和针头将 白色念珠菌 菌株 SC5314 划线到酵母蛋白胨 - 葡萄糖 - 腺嘌呤 （YPDA） 琼脂平板上。
2. 将板在 30 °C 下倒置孵育 2 天。
   注意:含有 白色念珠菌 的 YPDA 琼脂平板可在 4 °C 下储存长达 1 个月。
3. 使用无菌移液器吸头从板中分离出单个菌落，以接种到 50 mL 试管中的 10 mL YPDA 培养基中。
4. 在 30 °C 下孵育，以 230-250 rpm 振荡 ~17 小时。
5. 将酵母悬....

Results

在这里，我们展示了白色念珠菌的皮内感染模型，以研究皮肤 DC 介导的 Th17 免疫反应在体内的作用。在将白色念珠菌初次皮内注射到脚垫中后，皮肤引流 LN 扩大（图 2A）。在致敏期间，CD4 ⁺ 与 CD8 ⁺ 效应 T 细胞的比率显着增加（图 2B、C）。此外，相对于效应 CD8 ⁺ T 细胞，效应 CD4 ⁺ T 细胞大量产生 IL-17A（图 2D，E）。这些结果表明，皮内白色念珠菌感染有效驱动产生 IL-17A 的 CD4⁺ T 细胞免疫。

在白色念珠菌攻击的脚垫皮肤中观察到干扰素 γ （Ifnγ） 、 I.......

Discussion

本文描述了一种皮内白色念珠菌感染的方法，该方法允许研究皮肤 DC 在体内 Th17 免疫反应中的作用。通过对 DT 诱导的小鼠品系进行多参数流式细胞术分析，我们发现 CD301b⁺ 皮肤 DC 是启动针对深层皮肤白色念珠菌感染的 Th17 免疫的关键皮肤 DC 亚群。此外，结果表明，产生 IL-17 的 T 细胞反应主要由 CD4⁺ 产生，而不是由 CD8⁺ T 细胞产生，表明该模型是体内 Th17 免疫的忠实模型。

先前的优雅研究表明，表皮白色念珠菌感染通过产生 IL-6 的表皮 LC 导致 Th17 免疫^14,16。此外，对白色念珠菌表皮感染的 Th17 反应是由酵母形式特异性诱导的，而不是由白色念珠菌的菌.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mL （31 G） 胰岛素注射器	BD	328822
1x 烫发/洗涤缓冲液	BD	554723
1 mL （30 G） 注射器胰岛素注射器	BD	328818
24 孔板	Falcon	353047
50 mL 锥形管	Falcon	50050
70 μm 过滤器	Falcon	352350
70% 乙醇
ABI StepOnePlus 实时 PCR 系统	Applied Biosystems
麻醉室	哈佛仪器
Brefeldin A	BD	BD
555029β-巯基乙醇	Gibco	21985023
念珠菌白色念珠菌菌株 SC5314			由匹兹堡大学的 Daniel Kaplan 提供
CD3	BioLegend	100216	克隆 17A2
CD301b-DTR 小鼠			由耶鲁大学的 Akiko Iwasaki 提供
CD4	BioLegend	100408	克隆 GK1.5
CD44	eBioscience	47-0441-80	克隆 IM7
CD8a	BDBiosciences 553031		克隆 53.6.7
离心
机咔嗒声计数器
比色皿	Kartell	KA.1938
Cytofix/Cytoperm 溶液	BD	554722
白喉毒素 （DT）	Sigma
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）	Welgene	LB001-02
FACS（荧光激活细胞分选）缓冲液	内部
Fc 受体阻滞剂	BD	553142
胎牛血清 （FBS）	Welgene	S101-07
收获样品	镊子	Roboz
球计数器	Fisher Scientific	267110
杂交-R 总 RNA 试剂盒	GeneAll Biotechnology	305-101
羟乙基哌嗪乙烷磺酸 （HEPES）	Gibco	15630-080
IL-17A（细胞内细胞因子）	BioLegend	506912	克隆 TC11-18H10.1
离子霉素	Sigma	I0634
异氟烷
Langerin-DTR			由韩国科学技术院的 Heung Kyu Lee 提供
LIVE/DEAD 可固定水死细胞染色试剂盒	Invitrogen	L34957
定量环和针	SPL	90010
莫能菌素	BD	BD554724
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
青霉素	Gibco	15140-122
培养皿	SPL	10090
佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯 （PMA）	Sigma	P8139
PrimeScript RT 预混液	Takara Bio	RR360A
RPMI 1640	Gibco	11875-093
用于	收获样品	Roboz
不锈钢珠，5 mm	QIAGEN	69989
无菌移液器吸头
SYBR Green Premix Ex Taq II	Takara Bio	RR820A
TCRβ	BioLegend	109228	克隆 H57-597
热混合器 C	Eppendorf
TissueLyser	QIAGEN
UV-VIS 分光光度计	PerkinElmer
野生型 C57BL/6 小鼠	Orient Bio		使用 7 至 9 周龄小鼠
酵母蛋白胨-葡萄糖-腺嘌呤 （YPDA） 培养基，液体，无菌（1% 酵母提取物、2% Bacto 蛋白胨、2% 葡萄糖）
YPDA 琼脂平板，无菌（1% 酵母提取物、2% Bacto 蛋白胨、2% 葡萄糖、2% Bacto 琼脂）