Estimulação dural e teste periorbital von Frey em camundongos como um modelo pré-clínico de dor de cabeça

Summary

O sintoma mais notável da enxaqueca é a dor severa na cabeça, e é supor que isso é mediado por neurônios sensoriais que inervam as meninges. Aqui, apresentamos um método para aplicar localmente substâncias à dura de forma minimamente invasiva ao usar a hipersensibilidade facial como saída.

Abstract

As meninges cranianas, compostas pela dura mater, aracnoide e pia mater, são pensadas para servir principalmente funções estruturais para o sistema nervoso. Por exemplo, eles protegem o cérebro do crânio e ancoram/organizam o suprimento vascular e neuronal do córtex. No entanto, as meninges também estão implicadas em distúrbios do sistema nervoso, como a enxaqueca, onde a dor experimentada durante uma enxaqueca é atribuída à inflamação estéril local e posterior ativação de aferentes nociceptivos locais. Das camadas nas meninges, a dura-mater é de particular interesse na fisiopatologia das enxaquecas. É altamente vascularizado, abriga neurônios nociceptivos locais, e abriga uma variedade diversificada de células residentes, como células imunes. Mudanças sutis no microambiente meningeal local podem levar à ativação e sensibilização dos nociceptores perivasculares durais, levando assim à dor da enxaqueca. Estudos têm procurado abordar como os aferentes durais se tornam ativados/sensibilizados usando eletrofisiologia in vivo, técnicas de imagem ou modelos comportamentais, mas estes geralmente requerem cirurgias muito invasivas. Este protocolo apresenta um método para aplicação comparativamente não invasiva de compostos na dura-idade em camundongos e um método adequado para medir a sensibilidade tátil semelhante à dor de cabeça usando testes periorbitais von Frey após a estimulação dural. Este método mantém a integridade da dura e do crânio e reduz os efeitos de confusão de técnicas invasivas ao injetar substâncias através de uma cânula modificada de 0,65 mm na junção de suturas sagicionais e lambdoides não afusadas. Este modelo pré-clínico permitirá que os pesquisadores investiguem uma ampla gama de estímulos duradouros e seu papel na progressão patológica da enxaqueca, como ativação de nociceptor, ativação de células imunes, alterações vasculares e comportamentos de dor, tudo isso mantendo condições livres de lesões no crânio e meninges.

Introduction

A dor da enxaqueca continua sendo um grande problema de saúde pública em todo o mundo. A Organização Mundial da Saúde classifica-a como a sexta doença mais prevalente no mundo, acometendo pouco menos de 15% da população da Terra¹ e causando uma carga socioeconômica substancial sobre a sociedade ^2,3. As opções de tratamento e sua eficácia têm sido subótimas e apenas proporcionam alívio sintomático e não modificam significativamente eventos fisiopatológicos que subjacentes à ocorrência^{de enxaqueca 4,5}. A falta de sucesso do tratamento deve-se provavelmente à enxaqueca ser uma doença multifatorial cuja patologia é mal compreendida, levando a um número limitado de alvos terapêuticos. A enxaqueca também é desafiadora para capturar totalmente em modelos animais, especialmente dado que o diagnóstico de enxaqueca é feito com base na comunicação verbal com pacientes que descrevem sua experiência com marcas de enxaqueca, como aura, dor de cabeça, fotofobia e aodynia. Não obstante, é importante notar que os recentes avanços nos tratamentos para enxaqueca estão atualmente superando os tratamentos para muitas condições neurológicas que foram bem validadas por modelos pré-clínicos. Por exemplo, anticorpos monoclonais e pequenas moléculas que visam o peptídeo relacionado à calcitonina, ou seu receptor têm sido muito bem sucedidos em melhorar a qualidade de vida dos portadores de enxaqueca e podem potencialmente transformar o manejo clínico da enxaqueca. Embora tenha havido avanço na compreensão desse transtorno, ainda não há muito a ser elucidado.

Com base em modelos de animais pré-clínicos e estudos humanos, é amplamente aceito que as dores de cabeça da enxaqueca são iniciadas pela ativação aberrante de fibras nociceptivas dentro das meninges que sinalizam através da gânglio dorsal trigêmeo e superior 6,7,8,9,10. Apesar dessa teoria, muitos estudos ainda utilizam a administração sistêmica de drogas para entender mecanismos subjacentes contribuintes na enxaqueca. Embora a dosagem sistêmica de drogas tenha reforçado substancialmente nosso entendimento, esses achados não avaliam diretamente se as ações locais dentro do tecido alvo de interesse desempenham um papel na enxaqueca. Por outro lado, vários estudos têm tomado uma abordagem para estimular a dura; no entanto, esses experimentos requerem implantação de cânula através de uma craniotomia invasiva e^{recuperação estendida vezes 11,12}. Por causa dessas limitações, desenvolvemos uma abordagem minimamente invasiva para estimular localmente a dura duração onde a falta de uma craniotomia elimina a recuperação pós-cirúrgica e permite o teste imediato em animais acordados 12,13,14. Estas injeções são realizadas sob anestesia isoflurana leve e administradas na junção das suturas sagital e lambdoid em camundongos.

Várias abordagens foram desenvolvidas para avaliar respostas comportamentais nociceptivas em roedores¹⁵. A aodídia cutânea foi relatada em aproximadamente 80% dos portadores de enxaqueca^16,17 e representa um ponto final translacional potencial para uso em roedores. Em modelos pré-clínicos, a aplicação de filamentos von Frey na região plantar da pata de roedor tem sido usada para avaliar comportamentos de dor em modelos de enxaqueca pré-clínico. A principal limitação dessa abordagem é que ela não testa a região cefálica. A pontuação da careta facial tem sido usada para capturar comportamentos de dor em roedores, analisando expressões faciais após a indução de estímulos de dor^18,19. No entanto, suas limitações incluem apenas capturar respostas a estímulos agudos e não condições crônicas de dor orofacial. O preparo facial e a diminuição da criação também são considerados saídas de respostas comportamentais em modelos pré-clínicos de enxaqueca^20,21. As limitações do primeiro incluem a dificuldade em diferenciar as respostas à dor do preparo normal da rotina e outras sensações, como coceira. No caso deste último, os comportamentos de criação normalmente diminuem rapidamente após a introdução de roedores em novos ambientes. Embora cada um desses pontos finais comportamentais seja valioso na compreensão de vários mecanismos que contribuem para as condições de dor, há uma necessidade crítica de modelos pré-clínicos de distúrbios da dor, como enxaqueca, para incluir pontos finais que capturam especificamente respostas de hiperssensibilidade cefálica. Avaliar a hipersensibilidade tátil da pele periorbital após a estimulação dura é um método que pode fornecer uma melhor visão dos mecanismos que contribuem para enxaquecas onde os sintomas sensoriais são predominantemente cefálicos na natureza. Aqui, descrevemos um método para administrar substâncias na dura do rato como um modelo pré-clínico de enxaqueca. Após a aplicação dural, também apresentamos um método detalhado para testar a hipersensibilidade tátil periorbital usando filamentos von Frey calibrados aplicados no método de up-down de Dixon.

Protocol

Todos os procedimentos foram conduzidos com aprovação prévia do Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais na Universidade do Texas em Dallas. Foram utilizados neste estudo os camundongos ICR (CD-1) (30-35 g) e C57/BL6 (25-30 g) com idade entre 6 e 8 semanas. 1. Infusor dural Crie os infundadores/injetores do mouse modificando uma cânula interna e infusora disponível comercialmente para injeções unilaterais com uma tampa de plástico de sílica fundida não metálica q…

Representative Results

Este método de injeção é usado para administrar estímulos na duração de camundongos para que testes comportamentais subsequentes possam ocorrer. A saída comportamental mais comum medida com este modelo é a hipersensibilidade facial cutânea avaliada via von Frey 12,13,14. Aqui mostramos como esse modelo pode ser usado para avaliar potenciais contribuições específicas do sexo para a patologia da enxaqueca (<strong cla…

Discussion

As alterações maladaptivas no sistema nociceptivo local na dura são consideradas um dos principais contribuintes para a fase de dor de cabeça dos ataques de enxaqueca, apesar da falta de lesão tecidual^25,26. Aqui o estudo apresenta um método pelo qual a estimulação minimamente invasiva da dura dura pode induzir hipersensibilidade tátil facial. Elucidar os mecanismos e eventos envolvidos na ativação do nociceptor dural sem causar danos ao crânio e teci…

Materials

4 oz Hot Paper Cups	Choice Paper Company	5004W	https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html
Absorbent Underpads	Fisherbrand	14-206-65	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048
C313I/SPC Internal 28 G cannula	P1 Technologies (formerly Plastics One)	8IC313ISPCXC	I.D. 18 mm, O.D. 35 mm
Gastight Model 1701 SN Syringes	Hamilton	80008	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008
Ismatec Pump Tubing, 0.19 mm	Cole-Palmer	EW-96460-10	https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010
Stand with chicken wire	Custom		The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge
Testing Rack with individual  Chambers	Custom		Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup.
von Frey Filaments	Touch test/Stoelting	58011	https://www.stoeltingco.com/touch-test.html