基于适配体亲和微珠的微流控声泳技术用于革兰氏阴性菌的流通式分离

摘要

本文介绍了利用微流控声泳技术以及适配体修饰的微珠，制备和操作微流控声泳芯片的方法，该芯片可用于从培养基中快速、高效地分离革兰氏阴性菌。

摘要

本文介绍了一种利用微流控声泳技术及适配体修饰的微珠，用于从培养基中快速、高效分离革兰氏阴性菌的微流控声泳芯片的制备与操作方法。该方法通过结合长方形微通道结构，提高了分离效率。在该系统中，样品和缓冲液通过流量控制器注入入口端口。为实现微珠的居中定位和样品分离，通过信号发生器和功率放大器向压电换能器施加交流电，从而在微通道内产生声辐射力。芯片在入口和出口处均设有分叉通道，可同时实现分离、纯化和浓缩。该装置的回收率超过>98%，纯度可达10倍浓度剂量下的97.8%。本研究展示的回收率和纯度均高于现有细菌分离方法，表明该装置能够高效分离细菌。

引言

除了基于介电转移、磁泳、微珠提取、过滤、离心微流控、惯性效应以及表面声波的方法外，微流控平台也正在被开发用于从医学和环境样本中分离细菌^1,2。 对致病菌的检测通常采用聚合酶链式反应（PCR）进行，但该方法通常耗时较长、操作繁琐且复杂^3,4。微流控声泳系统为解决这些问题提供了替代方案，具有适中的通量和非接触式细胞分离的优势^5,6,7。声泳是一种利用声波引起物质移动现象来分离或富集微珠的技术。当声波进入微通道时，微珠会根据其尺寸、密度等特性被分选，同时细胞也可依据悬浮介质的生化和电学特性实现分离^7,8。因此，近年来已有大量关于声泳的研究被积极展开^9,10,11，并且最近已提出一种基于驻波表面声波微流控中边界驱....

方案

1. 微流控声泳芯片设计

注意：图1 展示了通过声泳法从微通道中分离和收集目标微珠的示意图。微流控声泳芯片使用CAD程序设计。

1. 设计一种微流控声泳芯片，该芯片使用适配体修饰的微珠与对应于细菌尺寸的链霉亲和素包被的聚苯乙烯（PS）微珠的混合物，以研究该装置的分离性能。
2. 设计一种微流控声泳芯片，在将PS样品混合物注入样品入口后，能够将PS微珠收集至目标出口，其余组分则通过废液出口排出（参见图2和Table 1）。
   注：为此目的，声流控芯片设计包含两个用于注入样品和缓冲液的入口、一个主通道以及附着的压电换能器（PZT），以实现微珠在通道中心的聚焦排列，同时设有两个出口用于收集目标样本并排出废液（图3A）
3. 设计一种微流控声泳芯片，使微珠、缓冲液、细菌和适配体共同流经主通道，并通过PZT诱导的片上声泳效应使微珠在通道中心对齐（图3B、C）

2. 微流控声泳芯片的制备

....

结果

图5 显示了微珠流动图像随压电陶瓷（PZT）电压（关闭、0.1 V、0.5 V、5 V）变化的情况。在本研究介绍的声泳芯片中，随着PZT电压的增加，10 µm大小微珠在通道中心的富集程度也随之增加。在PZT电压为5 V时，大部分10 µm大小的微珠均集中于通道中央。通过该结果，在单通道函数发生器中产生了3.66 MHz的共振频率，并使用功率放大器将信号放大了16 dB（约9倍）。

表3显示了将1 µm（细胞大小）和10 µm（适配体结合微珠）的混合微珠注入本研究所用的声流控芯片后，芯片在不同出口流速（400、450 和 475 µL/min）下的分离性能评估结果。回收率是指在出口收集到的10 µm微珠数量与注入的总微珠数量之比，分别为98% ± 2.2%、98% ± 2.5% 和 90% ± 9.8%。纯度是指收集到的微珠中10 µm微珠所占的比例，分别为97.1% ± 3.6%、97.6% ± 2.4% 和 99.4% ± 0.6%。这表明该装置对尺寸为10 µm的微珠具有较高的分离效率.......

讨论

我们开发了一种基于连续运行方法的声悬浮微流控装置，可根据革兰氏阴性菌（GN细菌）的尺寸、类型以及适配体修饰的微珠，实现从培养样品中高速捕获和转移细菌。该装置采用长方形微通道，相较于以往报道的二维声泳技术^{20,21,22,23,24,25,26}，具有更简化的结构设计和更高的成本效益。该装置在最高达10倍剂量浓度条件下，回收率可达>98%。本研究在细菌分离方面表现出高于现有无标记方法^{20,21,22<.......}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 µm 聚苯乙烯微珠	Bang Laboratories	PS04001	细胞尺寸微珠
10 µm 链霉亲和素包被微珠	Bang Laboratories	CP01007	适配体亲和微珠
4英寸硅片/SU-8模具	4science	29-03573-01	芯片组件
适配体	Integrated DNA Technologies	GN3-6'	用于细菌偶联的RNA
硼硅酸盐玻璃	Schott	BOROFLOAT 33	芯片组件
离心机	Daihan	CF-10	洗涤颗粒
氰基丙烯酸酯胶水	3M	AD100	将PZT粘附至微芯片
大肠杆菌 DH5α	KCTC	KCTC2571	目标细菌
函数发生器	GW Instek	AFG-2225	生成频率
高速相机	Photron	FASTCAM Mini	分离过程观察
加热板	As one	HI-1000	用于液态PDMS固化的加热板
KOVAX-SYRINGE 10 mL 注射器	Koreavaccine	22G-10ML	用无气泡去离子水填充微流控声泳通道
液态聚二甲基硅氧烷（PDMS）	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	芯片组件
LB肉汤（Miller培养基）	BD Difco	244620	细胞培养（Luria-Bertani培养基）
显微镜	Olympus Corp.	IX-81	分离过程观察
PBS缓冲液	Capricorn scientific	PBS-1A	洗涤细菌
PEEK管	Saint-Gobain Ppl Corp.	AAD04103	注入或收集颗粒
压电换能器	Fuji Ceramics	C-213	在通道中产生特定波形
功率放大器	Amplifier Research	75A250A	放大频率
压力控制器/μflucon	AMED	AMED-μflucon	气压/流量控制装置
Tris-HCl缓冲液	invitrogen	15567027	洗涤颗粒
管式旋转仪	SeouLin Bioscience	SLRM-3	修饰适配体与微珠