双向有丝分裂驱动蛋白-5 Cin8 在运动过程中会聚集形成不断分裂和融合的簇状结构。聚集形成簇状结构还会改变 Cin8 的运动速度和方向性。本文介绍了一种利用纯化的 Cin8-GFP 进行运动性检测的实验方案，以及对 Cin8 单分子和簇状结构运动特性的分析方法。
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摘要
摘要
有丝分裂双极驱动蛋白-5马达在纺锤体动力学中发挥着关键作用。这类马达蛋白具有同源四聚体结构，其活性复合物的两端各含有一对催化性马达结构域。这种独特的结构使驱动蛋白-5能够交联并推动反向平行的纺锤体微管（MTs）彼此滑动，从而产生将纺锤体两极向外推开的作用力。过去认为驱动蛋白-5仅朝微管正端移动，但近期研究表明，多种真菌来源的驱动蛋白-5在单分子水平上表现出朝微管负端移动的特性，并可在不同实验条件下发生运动方向的转换。 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 驱动蛋白-5 Cin8 就是一种具有双向运动特性的马达蛋白：在高离子强度条件下，Cin8 单分子沿微管（MTs）的负端方向运动。研究还表明，Cin8 会在微管的负端区域形成可运动的簇状结构，这种成簇现象使 Cin8 能够转换运动方向，实现缓慢的、朝向正端的运动。本文提供了使用 GFP 标记的驱动蛋白-5 Cin8 进行实验的完整操作流程，涵盖从蛋白在 S. cerevisiae 细胞及其纯化至 体外 单分子运动性分析。本文介绍了一种新开发的方法，可根据荧光强度区分Cin8单分子与Cin8聚集体。该方法可分别分析Cin8单分子和聚集体的运动性，从而实现对Cin8运动性与其聚集体大小之间依赖关系的表征。
引言
真核细胞内的大量运动过程由分子马达蛋白的功能介导。这些马达蛋白沿着细胞骨架纤维（包括肌动蛋白丝和微管（MTs））移动，并将ATP水解的化学能转化为细胞内生物运动所需的动能和机械力。S. cerevisiae 中基于微管的Cin8是一种双极性同源四聚体kinesin-5马达蛋白，能够交联纺锤体微管并使其相互滑动1。Cin8在有丝分裂过程中发挥着关键作用，参与纺锤体组装2,3,4以及后期（anaphase）的纺锤体延长过程5,6,7。先前研究表明，Cin8是一种双向运动的马达蛋白，可在不同实验条件下切换运动方向。例如，在高离子强度条件下，单个Cin8马达向微管的负端移动；而在多马达聚簇状态、多马达微管滑动实验以及反向平行微管之间，Cin8马达主要向微管的正端移动8,9,10,
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方案
1. 缓冲液和试剂的准备
- 缓冲液
- -Leu 氨基酸缺陷型混合物：取腺嘌呤、尿嘧啶、色氨酸、组氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸各 2 g 混合，室温保存。
- 含棉子糖的酵母选择性培养基（1 L）：将 6.7 g 酵母氮源基础（含硫酸铵）、2 g -Leu 氨基酸缺陷型混合物和 20 g 棉子糖溶于双蒸水中，搅拌（无需加热）至完全溶解。使用 0.22 µm 滤器过滤溶液至无菌瓶中。
- 裂解缓冲液：在三蒸水中配制 25 mL 溶液，含 50 mM Tris、30 mM Pipes、500 mM KCl、10% 甘油、1.5 mM β-巯基乙醇、1 mM MgCl2、0.1 mM ATP 和 0.1% Triton X-100。用 6 M HCl 调节 pH 至 8。
- 洗脱缓冲液：在三蒸水中配制 10 mL 溶液，含 50 mM Tris、30 mM Pipes、500 mM KCl、350 mM 咪唑、10% 甘油、1.5 mM β-巯基乙醇、1 mM MgCl2、0.1 mM ATP 和 0.1% Triton X-100。用 6 M HCl 调节 pH 至 7.2。
- P12 缓冲液：在三蒸水中配制 10 mL 溶液，含 12 mM Pipes、1 mM EGTA 和 2 mM MgCl2。用 10 M NaOH 调....
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结果
本实验旨在研究不同簇大小的双向运动蛋白Cin8在单根微管（MT）上的运动特性。从图5A中的时空图也可明显看出Cin8-GFP的代表性运动行为，其中显示了马达蛋白随时间变化的空间位置。
为分析Cin8-GFP的运动特性，首先为每个与微管结合的运动性Cin8-GFP颗粒分配簇大小（步骤4.3），然后追踪所检测的Cin8颗粒位置随时间的变化（步骤4.4）。针对每个簇大小类别， >从记录中提取了40条单独的Cin8-GFP运动轨迹（图5B）。根据追踪分析获得的坐标，对每个簇大小群体分别进行MD和MSD分析。速度值通过MD的线性拟合获得，如文中所示 图5C. 研究发现，单个Cin8-GFP分子以高速度向微管负端进行单向运动，而Cin8聚集体则表现出明显较低的运动速度，并更倾向于双向运动（图5B, C).
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讨论
本研究介绍了利用双向驱动蛋白-5 Cin8 进行单分子运动实验的方案及运动分析方法。全长 Cin818（包含C端天然核定位信号（NLS））已从天然宿主 S. cerevisiae 中纯化获得。由于 Cin8 是一种核内马达蛋白，研磨液氮中的 S. cerevisiae 细胞被发现是最有效的细胞裂解方法。裂解后，通过结合金属亲和层析和尺寸排阻层析，可获得高纯度的 Cin8，这对于单分子运动实验至关重要。先前已有报道指出，Cin8 在粗提物与纯化样品中的运动特性存在差异8。此外，也有研究报道，微管上马达蛋白和非马达蛋白的拥挤效应会影响双向驱动蛋白-5 Cut7 的运动方向性22。因此，为获得可靠的运动分析结果并得出有关野生型与突变型马达蛋白行为的准确结论，必须使用高纯度的马达蛋白。本文所述技术可经适当的缓冲液调整后，便捷地应用于从酵母中纯化其他核蛋白。
本文介绍了一种利用GFP标记的Cin8进行的高稳健性和高.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究部分得到了以色列科学基金会资助（ISF-386/18）和以色列二国科学基金会资助（BSF-2019008）的支持，上述资助授予 L.G.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 腺嘌呤 | 用于培养基 | DOC0230 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| 生物素标记的BSA | Sigma | A8549 | |
| 酪蛋白 | Sigma | C7078 | |
| 过氧化氢酶（C40） | Sigma | C40 | |
| 肌酸激酶 | Sigma | C3755 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma | D0632 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| GFP荧光滤光片组 | 色度 | 49002：ET-EGFP（FITC/Cy2） | |
| 罗丹明荧光滤光片组 | 色度 | 49004：ET-CY3/TRITC | |
| 荧光倒置显微镜 | Zeiss | Axiovert 200M | |
| 半乳糖 | Tivan Biotech | GAL02 | |
| 葡萄糖 | Sigma | G8270 | |
| 葡萄糖氧化酶 | Sigma | G7141 | |
| 甘油 | Sigma | G5516 | |
| 甘氨酰甘氨酸 | 默克 | G0674 | |
| GMPCPP | Jana Bioscience | Nu-405L | |
| GTB | 细胞骨架 | BST01-010 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| 组氨酸 | Duchefa Biochemie | H0710.0100 | |
| ImageJ-FIJI 软件 | https://imagej.net/plugins/trackmate/ | 版本 2.1.0/1.53c；适用于 Windows 10 的 Java 1.8.0_172 [64 位] | |
| 咪唑 | Sigma | I0125 | |
| InstantBlue 考马斯亮蓝蛋白质染色液 | Abcam | ab119211 | |
| 透镜 | Zeiss | 100x/1.4 油镜 DIC 物镜 | |
| 赖氨酸 | 用于培养基 | DOC0161 | |
| 氯化镁 | Sigma | M8266 | |
| 甲硫氨酸 | Duchefa Biochemie | M0715.0100 | |
| Neo | Andor Technologies | sCMOS相机 | |
| NeutraAvidin | 生命 | A2666 | |
| Ni-NTA 琼脂糖 | Invitrogen | R901-15 | |
| 磷酸肌酸 | Sigma | P1937 | |
| 管道 | Sigma | P1851 | |
| 泊洛沙姆 F-127（Pluronic acid F-127） | Sigma | P2443 | |
| 氯化钾 | Sigma | P9541 | |
| 棉子糖 | Tivan Biotech | RAF01 | |
| 尺寸排阻色谱仪器 | GE Healthcare | AKTA Pure | |
| 分光光度计 | ThermoFisher Scientific | NanoDrop | |
| Superose-6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| Tris | Roshe | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 色氨酸 | Duchefa Biochemie | T0720.0100 | |
| 微管蛋白 | 细胞骨架 | T240 | |
| 微管蛋白，生物素化 | 细胞骨架 | T333P | |
| 微管蛋白，TRITC罗丹明 | 细胞骨架 | TL530M | |
| 尿嘧啶 | Sigma | U0750-100G | |
| 酵母氮源基础 | 培养基 | CYN0401S | |
| α-GFP 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC8036 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma | M3148 |
参考文献
- Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
- Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S.
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 6/09/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.
One of the author names was updated from:
Roy Abraham
to:
Roy Avraham
