使用环形离子淌度质谱仪进行串联离子淌度实验

摘要

离子淌度质谱法（IMS）是质谱技术在生物分子表征方面的一种有益补充，尤其因为它对同分异构现象具有敏感性。本方案描述了一种串联离子淌度（IMS/IMS）实验，可实现对特定分子的选择性分离，并生成其碎片的淌度谱图。

摘要

准确表征化学结构对于理解其潜在的生物学机制和功能特性至关重要。质谱法（MS）是一种常用工具，但并不总是足以完全揭示所有结构特征。例如，尽管碳水化合物具有重要的生物学意义，但由于存在多个层次的异构现象，其表征过程十分复杂。离子淌度谱法（IMS）是一种很有前景的补充技术，因为它对离子构象敏感，因而能够区分异构体。

此外，近年来的技术进步显著改进了该方法：与线性离子淌度谱（IMS）仪器相比，新一代的环状离子淌度谱（Cyclic IMS）仪器提供了更多功能，例如更高的分辨能力，或进行串联离子淌度（IMS/IMS）实验的可能性。在IMS/IMS实验中，首先根据离子的淌度选择特定离子，随后将其碎裂并重新分析，以获得其碎片的离子淌度信息。最近的研究表明，此类IMS/IMS数据中碎片的淌度谱图可作为特定聚糖的“指纹”特征，并可用于分子网络分析策略，以在结构上合理的方式对糖组学数据集进行组织。

本实验方案的目标是描述如何从样品制备到离子淌度维度的碰撞截面（CCS）校准，获得可重复的质谱谱图，从而生成IMS/IMS数据。以一种代表性糖链为例，本方案将展示如何在环形离子淌度质谱仪（Cyclic IMS）上构建IMS/IMS控制序列，如何利用该控制序列将离子到达时间转换为漂移时间（即实际施加于离子的分离时间），以及如何从原始数据中提取相关的淌度信息。本方案旨在清晰阐明IMS/IMS实验中的关键步骤，帮助初次使用环形离子淌度质谱仪的研究人员顺利完成简单且可重复的数据采集。

引言

对生物分子进行全面的化学表征是理解其潜在生物学功能特性的关键。为此，近年来发展出了"组学"科学，旨在对生物浓度下的化学结构进行大规模表征。在蛋白质组学和代谢组学中，质谱（MS）已成为揭示生物介质中结构异质性的核心技术，这尤其得益于其高灵敏度以及通过串联质谱（MS/MS）提供结构信息的能力。在MS/MS策略中，首先根据质量选择某一离子，随后使其碎裂，最终采集其碎片的质量，从而建立该分子的指纹图谱。MS/MS谱图尤其可用于比对谱图数据库^1,2，或尝试重建母体结构^3,4。基于“相似谱图对应相似化合物”的假设，MS/MS数据还可用于构建分子网络（MNs），通过相似性评分将相关分子物种相互关联^5,6。

然而，由于质谱（MS）技术本质上只能检测离子的质荷比（m/z），该方法对多种处于（立体）异构范围内的结构特征不敏感。例如，碳水化合物由多个单糖亚基组成，其中许多互为立体异构体，甚至为差向异构体（如 Glc 与 Gal，或 Glc 与 Man）。这些亚基通过糖苷键连接，而糖苷键在连接位置（位置异构）和异头碳的....

方案

注意：本方案的概述见图1。本方案中所述实验所使用的参数详见补充表S1和补充表S2。

1. 样品溶液的制备

注意：本方案以阿拉伯木聚糖五糖（2³-α-L-呋喃型阿拉伯糖基-木四糖或 XA²XX；参见材料表）为例进行描述。

1. 溶剂的配制： 500 µM LiCl 在 50:50 H₂O:MeOH（体积比）。
   1. 配制 100 mM 氯化锂（LiCl）储备液，溶剂为 H₂O，通过称取212 mg LiCl并加入50 mL高纯度去离子水（H₂O）加入50 mL聚丙烯锥形管中，振荡至完全溶解。
      注意：溶剂中掺入锂盐以促进[M+Li]的形成⁺ 加合物在质谱仪离子源中的应用通常能产生比其他碱金属加合物质量更高的碎片谱图。建议使用 LiCl，因为先前研究发现有机酸（及其盐）会影响离子迁移谱（IMS）的谱图特征²³.
   2. 在玻璃瓶中，将LiCl储备液稀释200倍： 250 µL 的贮存液，加入 24....

结果

以阿拉伯木聚糖五糖 XA²XX 为例说明本实验方案。该化合物可商业获得，但仅以与另一种阿拉伯木聚糖五糖 XA³XX 的混合物形式提供（纯的 XA³XX 也可商业获得）。XA²XX 和 XA³XX 的结构见补充图 S1。由于商业混合物中 XA²XX 与 XA³XX 的比例约为 50:50，因此配制浓度为 20 µg/mL 的混合物溶液，以在 50:50 MeOH/H₂O + 500 µM LiCl 体系中使 XA²XX 的浓度达到约 10 µg/mL。

首先，采用高分辨质谱对 XA²XX + XA³XX 混合物进行质谱分析。由于这两种化合物为同分异构体，仅在 [M+Li]⁺m/z 685.24 处观察到一个单一质谱峰。通过四极杆选择该质谱峰，并调整选择窗口以去除 -1 Da.......

讨论

SELECT SERIES Cyclic IMS 是一种强大的工具，能够在无需上游色谱分离的情况下，选择特定质荷比（m/z）和离子淌度的离子群体。该仪器可生成该离子群体的二维碎片图谱，并从中提取出 MS/MS 和 IMS/IMS 谱图。然而，用户在实验过程中必须注意若干需要特别关注的关键点。

首先，用户应仔细检查质谱隔离窗口中是否存在可能的同重数干扰物。实际上，四极杆的隔离窗口相对较宽，了解可能在四极杆中被共选出的、m/z 略有差异的离子，将有助于用户在离子淌度中正确指认目标峰。

其次，在进行初始分离时，操作者必须确保所有离子在循环离子淌度池中经历相同次数的循环。这是循环式装置中离子淌度分离的一个重要且关键的环节。若对特定离子的循环次数评估错误，可能导致峰的错误鉴定与误读。由于单次循环路径较短（约1米），不同离子群体的循环次数控制较为困难，淌度差异较大的物种可能迅速发生重叠。

特别地，当离子群通过时，若阵列改变方向，则一个峰可能在两次不.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
33-α-L- 与 23-α-L-阿拉伯呋喃糖基-木寡四糖（XA3XX/XA2XX）混合物	Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland	O-XAXXMIX	XA2XX + XA3XX 混合物
33-α-L-阿拉伯呋喃糖基-木寡四糖（XA3XX）	Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland	O-XA3XX	纯 XA3XX 标准品
Eppendorf Safe-Lock 离心管，1.5 mL，Eppendorf 品质，无色，1,000 支	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030120086	用于制备碳水化合物储备液及其稀释液
FALCON 50 mL 聚丙烯锥形离心管，30 × 115 mm	Corning Science México S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico	352070	用于制备 100 mM LiCl 水溶液储备液
氯化锂（ACS 级试剂，≥99%）	Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France	310468	用于向样品中掺杂锂离子
Major Mix IMS/Tof 校准试剂盒	Waters Corp., Wilmslow, UK	186008113	质谱与离子淌度校准溶液
MassLynx 4.2 SCN1016 版本 6（Waters 嵌入式分析平台，Cyclic IMS 2.9.1 版本 9）	Waters Corp., Wilmslow, UK	721022377	用于仪器控制与数据处理的 Cyclic IMS 厂商软件
用于 HPLC 的甲醇，PLUS 梯度级	Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France	412383	高纯度溶剂
MS 亮氨酸脑啡肽试剂盒	Waters Corp., Wilmslow, UK	700002456	用于质谱仪调谐的参考化合物
SCHOTT DURAN 100 mL 硼硅酸盐玻璃瓶	VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US	218012458	用于制备 50:50 MeOH/水溶液中 500 µM LiCl 溶液
SELECT SERIES Cyclic IMS	Waters Corp., Wilmslow, UK	186009432	配备环形离子淌度池的离子淌度-质谱联用仪
网站：http://mzmine.github.io/	MZmine 开发团队	-	MZmine 软件下载链接
网站：https://github.com/siollivier/IM-MN	INRAE, UR BIA, BIBS 设施，南特，法国	-	内部 R 脚本下载链接，包含 CCS 校准函数