本方案介绍了如何基于微流控芯片构建连续流动聚合酶链式反应系统，以及如何在实验室中搭建毛细管电泳系统。该方法为实验室中核酸分析提供了一种简便的途径。
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本文内容
摘要
摘要
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于扩增目标基因的传统方法，在生物分子诊断中发挥着重要作用。然而，由于传统PCR的温度变化效率较低，耗时较长。本研究提出了一种基于微流控芯片的连续流动PCR（CF-PCR）系统。通过将PCR溶液引入置于不同温度加热器上的微通道中，可显著缩短扩增时间。此外，毛细管电泳（CE）是区分阳性与假阳性PCR产物的理想方法，因此构建了CE系统以实现DNA片段的高效分离。本文描述了利用自主搭建的CF-PCR系统对大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）进行基因扩增，并通过CE检测PCR产物的过程。结果表明，E. coli的目标基因在10分钟内成功扩增，证明这两种系统可用于核酸的快速扩增与检测。
引言
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，可将微量DNA扩增数亿倍。该技术已广泛应用于临床诊断、医学研究、食品安全、法医鉴定等领域。PCR过程主要包括三个步骤：90-95 °C的变性、50-60 °C的退火以及72-77 °C的延伸。热循环是PCR过程中的关键环节；然而，传统的PCR热循环仪不仅体积庞大，而且效率较低，完成25个循环大约需要40分钟。为克服这些局限，本研究自行构建了一种基于微流控芯片的连续流动PCR（CF-PCR）系统。CF-PCR通过将PCR溶液驱动至置于不同温度加热器上的微通道中，可显著节省反应时间1,2,3,4,5。
毛细管电泳（CE）具有诸多优势，例如高分辨率、高速度和优异的重复性6,7,8,9,
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方案
注意：本实验方案中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息，请参见材料表。
1. CF-PCR 微流控芯片的制备
- 将硅片在 200 °C 下加热 25 分钟，以去除水分。
- 每英寸硅片使用 1 mL SU-8-2075 光刻胶。使用匀胶机在硅片上旋涂，先以 100 rpm/s 的加速度在 500 rpm 下旋转 5–10 秒，然后以 500 rpm/s 的加速度在 2,000 rpm 下旋转 30 秒。
- 将硅片在 65 °C 下预烘 3 分钟，然后在 95 °C 下烘烤 15 分钟。
- 将光刻机的曝光能量设置为150–215 mJ/cm²，使用光刻掩模将设计好的图案刻蚀到光刻胶上。将硅片和掩模放置到位，准备曝光。
- 曝光后，将硅片在 65 °C 下烘烤 2 分钟，然后在 95 °C 下烘烤 7 分钟。
- 将硅片浸入显影液中以去除多余的光刻胶，当观察到微通道时取出（图 1）。用异丙醇冲洗残留的显影液。
- 按 10:1 的比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物与固化剂。将混合后的 PDMS 溶液倒入复制模具中，并在 80 °C 下固化 60 分钟。 ....
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结果
图5 显示了PCR产物和DNA标记物的电泳图谱。图5A 为CF-PCR扩增产物的毛细管电泳（CE）结果，图5B 为热循环扩增产物的CE结果，图5C 为100 bp DNA ladder的CE结果。我们首先在CF-PCR系统中扩增了E. coli的目标基因，PCR溶液从芯片入口到出口耗时约10分钟30秒。E. coli目标扩增片段的大小为544 bp。扩增后的PCR产物在CE系统中进行分析，同时在相同实验条件下对100 bp DNA ladder进行毛细管电泳。PCR产物的大小可根据DNA ladder的电泳图谱进行评估。每个实验均重复三次以确保可重复性。图5 中的数据表明，分离后可观察到对应于E. coli PCR产物的峰，且微流控芯片中PCR产物的迁移时间与热循环仪中的结果一致。
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讨论
PCR 和毛细管电泳（CE）是核酸分析中两种常用的生物技术。本文描述了 大肠杆菌 以及使用自制的CF-PCR和CE系统对PCR产物进行检测。目标基因为 E. coli 由于高效的热传递，10分钟内成功完成了扩增。小于1,500 bp的DNA片段在8分钟内实现分离（图5这两种技术的最大优势在于，与传统的PCR和平板凝胶电泳方法相比，可大幅节省时间。研究人员需注意，使用后的CF-PCR微流控芯片需要清洗，CE系统应置于洁净且避光的环境中，以避免样品污染。本文介绍的基于微流控芯片的CF-PCR系统与CE系统易于制备，可能为实验室核酸分析提供一种简便的方法。然而，CF-PCR的一个局限性在于每次只能扩增和检测一个样本，这可能限制其广泛应用；为解决此问题，用户可开发集成化的CF-PCR与CE阵列微流控芯片。本研究所报道的平台在感染性疾病临床诊断和核酸研究领域具有广阔的应用前景。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了中国上海市科学技术委员会（编号：19ZR1477500 和编号：18441900400）以及上海理工大学（编号：2017KJFZ049）的经费支持，特此致谢。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 bp DNA Ladder | Takara Bio 公司 | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio 公司 | RR070A | |
| 10x TBE | 北京索莱宝科技有限公司 &有限公司 | T1051 | |
| 显影液 | Alfa Aesar，美国 | L15459 | |
| dNTP 混合物（2.5 μM | Takara Bio 公司 | RR070A | |
| EC-F | 中国上海桑谷生物技术有限公司 | ||
| EC-R | 中国上海 Sangon Biotech | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich，美国 | 9004-62-0 | |
| 异丙醇 | Aladdin，中国上海 | 67-63-0 | |
| 显微镜 | 日本 Olympus | BX51 | |
| 光刻 | SUSS MicroTec，德国 | MJB4 | |
| 光电倍增管 | 日本滨松光子学株式会社 | R928 | |
| 光刻胶 | MicroChem，美国 | SU-8 2075 | |
| PID 温度控制器 | 中国上海 | XH-W2023 | |
| 等离子清洗机 | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| 聚乙烯吡咯烷酮（PVP） | 中国上海阿拉丁 | P110608 | |
| 泵 | 哈佛仪器公司 | PHD2000 | |
| 硅胶管 | BIO-RAD，美国 | 7318210 | |
| 固态继电器 | 中国台湾 | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA聚合酶 | Takara Bio 公司 | RR070A | |
| 钢针 | 中国苏州中鑫启恒 | ||
| SYBR GREEN <图片替代文本"公式 1" src="/files/ftp_upload/63523/63523eq01.jpg" 样式="margin: auto;"/> | Solarbio，北京，中国 | SY1020 | |
| 温度传感器 | EasyShining Technology，中国成都 | TCM-M207 | |
| 模板（E. coli) | Takara Bio 公司 | AK601 | |
| Tween 20 | 中国上海阿拉丁 | T104863 | |
| 电压电源 | 美国纽约州梅迪纳 | TREK MODEL 610E |
参考文献
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B.
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重印与许可
