本文描述了一种基于质谱的蛋白质组学方法，用于对具有已知组织命运的脊椎动物Xenopus laevis胚胎中的细胞谱系进行表征。
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本文内容
摘要
摘要
细胞发育为组织和器官过程中的分子事件表征，有助于更深入理解正常发育机制，并为疾病设计高效的治疗方案。能够精确鉴定和定量大量及多种类型蛋白质的技术，将提供目前尚缺失的、关于组织和生物体在时空上协调发育的分子机制信息。本文介绍一种基于质谱的实验方案，可在Xenopus laevis（青蛙）胚胎中对已知细胞谱系的数千种蛋白质进行定量检测。该方法基于可重复的细胞命运图谱，结合已建立的技术，用于识别、荧光标记、追踪以及采样特定细胞及其后代（克隆），这些技术均来自脊椎动物发育的经典模型。通过显微取样、解剖分离或荧光激活细胞分选获取细胞内容物后，提取蛋白质并进行自下而上（bottom-up）的蛋白质组学分析。采用液相色谱和毛细管电泳实现蛋白质的可扩展分离，进而利用高分辨质谱（HRMS）进行高精度的蛋白质检测与定量。本文以神经组织命运决定细胞的蛋白质组学表征为例，展示了该方法的应用。这种基于细胞谱系指导的高分辨质谱蛋白质组学技术可适用于不同组织和生物体，具有足够的灵敏度、特异性和定量能力，可用于深入探究脊椎动物发育过程中蛋白质组的时空动态变化。
引言
我们对细胞分化以及组织和器官发生的理解，是数十年来对基因及其产物进行精细靶向筛选的结果。深入了解重要细胞事件过程中所有生物分子及其含量，将有助于揭示控制脊椎动物体轴时空模式形成的分子机制。目前，能够实现分子扩增与测序的技术已可常规检测大量基因和转录本，从而支持基础生物学和转化研究中的假设驱动型研究。为了理解发育系统，鉴于转录与翻译之间存在复杂的关联，有必要对多种蛋白质及其翻译后修饰进行直接分析。基于全局蛋白质组学的 体外 生物系统，例如诱导多能干细胞，开始阐明组织诱导的机制1,2在复杂的生物体（如脊椎动物胚胎）中，发育过程依赖于形态发生素在时空背景下的浓度梯度3因此，了解细胞分化形成特化组织（如神经组织）过程中的蛋白质组变化，是揭示控制正常与异常发育的分子程序并指导下一代治疗策略的关键。
非洲爪蟾（Xenopus laevis）是一种在细胞与发育生物学、神经生物学以及再生生物学研究中广泛应用的脊椎动物模式生物。约翰·戈登爵士因发现体细胞核具有多能性而获得2012年诺贝尔生理学或医学奖4,5，这一成果凸显了该模型在基础研究和转化研究中的重要性。Xenopu....
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方案
所有确保人道饲养和操作成年非洲爪蟾（Xenopus laevis）的实验方案均经马里兰大学帕克分校机构动物护理和使用委员会批准（批准编号：R-DEC-17-57 和 R-FEB-21-07）。
1. 准备溶液
- 胚胎学实验
- 配制1倍、0.5倍和0.2倍浓度的Steinberg溶液（SS），然后按照标准操作规程进行高压灭菌（120 °C，20分钟）以确保无菌12。
- 按照标准操作规程，在灭菌的1倍SS中配制3%（w/v）的Ficoll溶液12。
- 去胶时，新鲜配制2%（w/v）的半胱氨酸溶液，并逐滴加入10 M氢氧化钠溶液调节pH至8。
警告：接触半胱氨酸可能导致皮肤和呼吸道损伤。氢氧化钠具有腐蚀性，直接接触可对皮肤和眼睛造成严重损伤。操作这些化学品时应佩戴适当个人防护装备（PPE），如手套和实验服。 - 用于谱系示踪时，将荧光葡聚糖以0.5%（v/v）的比例溶于无菌去离子水中。或者，将荧光蛋白mRNA（例如GFP）配制成0.2 µg/µL的溶液于无菌去离子水中。
- 用于细胞解离时，配制Newport 2.0缓冲液，包含0.1 M异乙磺酸钠、20 mM焦磷酸钠和10 mM CAPS，并将pH调至....
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结果
该方案使得在单细胞及其谱系形成组织的过程中对蛋白质进行研究成为可能 X. laevis 胚胎 图1 展示了该方法在研究神经组织命运细胞及胚胎中新诱导的神经外胚层中蛋白质的一种应用。如图所示 图1A生物分析工作流程结合了细胞与发育生物学的传统工具，用于识别、注射/吸取细胞以及采集样本。 图1B 显示对左侧背侧动物极（D11) 16细胞胚胎中的细胞 体内 使用显微注射仪；实验结束后，胚胎成功发育为具有正常解剖结构的蝌蚪56. 大型胚胎细胞（约100-250 µm 直径）也适用于手工显微解剖。对右侧背侧-动物极中线（D11) 细胞从16细胞期胚胎中示出 图1C该装置还允许通过向已鉴定的前体细胞注射荧光示踪剂来追踪克隆轨迹。如图所示
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讨论
本方案可实现对爪蟾（Xenopus）物种胚胎中已鉴定细胞谱系的蛋白质表达进行表征。该方法源于高分辨质谱（HRMS），结合了分子鉴定的极高特异性、无需分子探针即可同时检测多种蛋白质（通常为数百至数千种不同蛋白质）的能力，以及定量分析能力。该技术可与细胞和发育（神经）生物学中的经典工具和工作流程相兼容，从而将HRMS蛋白质组学拓展至一系列引人注目的应用，包括对脊椎动物非洲爪蟾（X. laevis）胚胎中干细胞分化的整体性表征。
本步骤描述了在X. laevis胚胎中进行的细胞谱系导向蛋白质组学研究。作为示例，我们展示了神经命运单细胞及其谱系的分析，并通过公共数据存储库提供了相应的毛细管电泳和纳米液相色谱高分辨质谱数据集（参见PRIDE）。该方法可轻松适用于多种细胞类型（及谱系）中蛋白质时空调控的研究。在发育胚胎中进行的时空导向蛋白质组学还可拓展至转录组学和代谢组学研究，以促进对细胞分化及关键器官（如神经系统）发育的分子系统生物学理解。
本方案为生物分析增添了新的维度。细胞培养，.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
我们感谢马里兰大学帕克分校的 Jie Li 在胚胎解离和流式细胞分选（FACS）方面的宝贵讨论。感谢 Vi M. Quach 和 Camille Lombard-Banek 在先前研究中对样本制备和数据收集提供的帮助，这些研究展示了本实验方案中重点介绍的蛋白质组学应用。本工作的部分内容得到了美国国家科学基金会 IOS-1832968 CAREER 项目（授予 P.N.）、美国国立卫生研究院 R35GM124755 项目（授予 P.N.）、马里兰大学与美国国家癌症研究所合作项目（授予 P.N.）以及 COSMOS Club Foundation 研究奖（授予 A.B.B. 和 L.R.P.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈（LC-MS级） | Fisher Scientific | A955 | |
| 琼脂糖 | ThermoFisher Scientific | R0492 | |
| 碳酸氢铵 | Fisher Scientific | A643-500 | |
| 分析柱 | Thermo Scientific | 164941 | |
| 分析型微量天平 | Mettler-Toledo | XSE105DU | |
| 自动肽段分离平台 | Agilent | 1260 Infinity II | |
| 硼硅酸盐毛细管 | Sutter Instruments Co. | B100-50-10 | |
| 硼硅酸盐毛细管（用于制作Emmitter） | Sutter Instruments | B100-75-10 | |
| C18离心柱（用于脱盐） | ThermoFisher Scientific | 89870 | |
| 电喷雾监测相机 | Edmund Optics Inc. | EO-2018C | |
| 康普拉他汀A4 | Millipore Sigma | C7744 | |
| 商用CESI系统 | AB SCIEX | CESI | |
| 环己氨基丙磺酸（CAPS） | VWR | 97061-492 | |
| 细胞松弛素D | Millipore Sigma | C8273 | |
| 葡聚糖，Alexa Fluor 488标记；分子量10,000，阴离子型，可固定 | ThermoFisher Scientific | D22910 | |
| 二硫苏糖醇 | Fisher Scientific | FERR0861 | |
| Dumont #5镊子 | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AAJ62786AP | |
| 落射荧光光源 | Lumencore | AURA III | |
| Eppendorf LoBind微量离心管：蛋白用 | Fisher Scientific | 13-698-793 | |
| 甲酸（LC-MS级） | Fisher Scientific | A117-50 | |
| 冷冻冰箱（-20 °C） | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| 超低温冰箱（-80 °C） | Thermo Scientific | TSX40086A | |
| 熔融石英毛细管 | Molex | 1088150596 | |
| 加热金属块 | Benchmark | BSH300 | |
| 高效液相色谱系统 | ThermoFisher Scientific | Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem | |
| 高压电源 | Spellman | CZE1000R | |
| 高分辨率质谱仪 | ThermoFisher Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | |
| HPLC瓶盖 | Thermo Scientific | C4013-40A | |
| HPLC小瓶 | Thermo Scientific | C4013-11 | |
| 照明装置（例如鹅颈灯） | Nikon | C-FLED2 | |
| Ingenuity通路分析软件 | Qiagen | ||
| 碘乙酰胺 | Fisher Scientific | AC122275000 | |
| 甲醇（LC-MS级） | Fisher Scientific | A456 | |
| 甲醇（LC-MS级） | Fisher Scientific | A456-4 | |
| 微毛细管拉制仪 | Suttor Instruments | P-2000 | |
| 显微注射器 | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| 微量移液器拉制仪 | Sutter Instruments Co. | P-1000 | |
| 质谱数据分析软件，商业版 | ProteomeDiscoverer | ||
| 质谱数据分析软件，开源版 | MaxQuant | ||
| 非离子型去污剂替代物NP-40 | Millipore Sigma | 11754599001 | |
| 培养皿（60 mm和80 mm） | Fisher Scientific | S08184 | |
| Pierce 10 µL填料Zip-tip（用于脱盐） | ThermoFisher Scientific | 87782 | |
| Pierce二辛可宁酸蛋白检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pierce定量比色肽检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23275 | |
| Pierce胰蛋白酶（质谱级） | Fisher Scientific | PI90058 | |
| 蛋白LoBind样品瓶 | Eppendorf | 0030108434 , 0030108442 | |
| 制冷离心机 | Eppendorf | 5430R | |
| 制冷培养箱 | Thermo Scientific | PR505755R/3721 | |
| 异乙磺酸钠 | Millipore Sigma | 220078 | |
| 焦磷酸钠 | Sigma Aldrich | 221368-100G | |
| 不锈钢BGE样品瓶 | 定制 | ||
| 不锈钢样品瓶 | 定制 | ||
| 体视显微镜（10倍物镜） | Nikon | SMZ 1270, SZX18 | |
| 蔗糖 | VWR | 97063-790 | |
| 注射泵（2台） | Harvard Apparatus | 704506 | |
| 气密性注射器：500–1000 µL | Hamilton | 1750TTL | |
| 移液管（塑料，一次性） | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 捕获柱 | Thermo Scientific | 164750 | |
| Tris-HCl（1 M溶液） | Fisher Scientific | AAJ22638AP | |
| 可在4–10 °C运行的真空浓缩仪 | Labconco | 7310022 | |
| 涡旋混合器 | Benchmark | BS-VM-1000 | |
| 水（LC-MS级） | Fisher Scientific | W6 | |
| 水（LC-MS级） | Fisher Scientific | W6 | |
| XYZ三维平移台 | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ三维平移台 | 定制 |
参考文献
- Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
- Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their ....
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重印与许可
