从小鼠视网膜获得的穆勒胶质细胞原代培养物是研究微小RNA处理后胶质细胞转化为视网膜前体细胞的一种非常稳健且可靠的工具。可在将其进一步应用于体内实验之前，利用该体系检测单个分子或分子组合的效果。 体内 方法。
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摘要
摘要
穆勒胶质细胞（MG）是神经视网膜中的主要胶质细胞，可作为视网膜神经元再生的来源。在鱼类等低等脊椎动物中，MG介导的再生可自然发生；而在哺乳动物中，则需要特定因子的刺激或基因/表观遗传学操作。由于MG仅占视网膜细胞总数的5%，因此需要能够特异性研究该细胞群体的模型系统。其中一种模型系统是原代MG培养，该系统具有可重复性，可用于多种应用，包括分子/因子的筛选与鉴定、化合物或因子的测试、细胞监测和/或功能检测。该模型可用于研究补充或抑制微小RNA（miRNAs）后小鼠MG转化为视网膜神经元的潜能 通过 转染人工miRNA或其抑制剂。结合使用小胶质细胞特异性报告小鼠、免疫荧光标记和单细胞RNA测序（scRNA-seq），证实这些培养物中80%–90%的细胞为小胶质细胞（MG）。利用该模型发现，miRNA可将MG重编程为视网膜前体细胞（RPCs），随后进一步分化为类神经元细胞。该技术的优势在于，可在将miRNA候选分子应用于体内实验之前，先对其效率和作用效果进行评估。 体内 应用。
引言
Müller胶质细胞（MG）是神经视网膜中的主要胶质细胞。它们的功能与其他中枢神经系统部位的胶质细胞相似，包括维持水和离子稳态、为神经元提供营养以及保护组织。MG还具有另一个引人注目的特征：尽管它们是成熟的胶质细胞，但仍表达许多在视网膜发育晚期阶段的视网膜前体细胞（RPCs）中表达的基因1,2。这种相似性被认为是鱼类视网膜受损后MG介导的神经元自然再生现象的原因3,4。在此过程中，MG重新进入细胞周期，并去分化为RPCs，随后分化为全部六种类型的视网膜神经元。尽管这一现象在鱼类中自然发生，哺乳动物的MG却不能转化为神经元5,6。然而，它们可以被重编程。已有多种因子被证明能够将MG重编程为RPCs/神经元；其中一种因子是碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子achaete-scute同源物1（Ascl1），该因子参与了鱼类的视网膜再生过程7,8。在小鼠中，Ascl1仅在视网膜发生过程中表达于RPCs中，而在成熟的MG或视网膜神经元中则....
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方案
涉及动物受试者的实验程序已获得纽约州立大学视光学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
注意：该培养方案包括三个阶段：生长期、转染期和转化期。整体方案的时间线总结见图1。
1. 培养基及所有所需试剂的准备
注意：所有步骤均需在A2或B2级生物安全柜（BSC）中进行。在生长阶段，使用含高血清的生长培养基，该培养基由基础神经元培养基添加表皮生长因子（EGF）组成。在转化阶段，则使用含低血清并添加神经元补充物的神经生理学基础培养基，以确保神经元的分化与存活。
- 通过在200 mL基础神经元培养基中添加20 mL胎牛血清（FBS，10%）、1 mL 200 mM L-谷氨酰胺（0.5%）、2 mL青霉素/链霉素（1%）和2 mL N2补充剂（1%）来配制生长培养基（用于生长阶段）。使用孔径为0.22 µm的滤器进行无菌过滤。使用前在37 °C金属珠浴中预热培养基。
- 根据生产商说明书（见材料表）配制神经元培养基（用于转化阶段）：在100 mL无血清神经生理学基础培养基中加入2 mL B27神经元补充剂（2%）、1 mL N2补充剂（1%）、20 µL 100 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF，....
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结果
本方案描述了如何从P12小鼠视网膜中培养穆勒胶质细胞（MG），并利用Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl 视网膜前体细胞（RPC）报告小鼠，通过miR-25将这些细胞重编程为视网膜神经元。此前的研究已详细报道了该方法可用于筛选其他适合的miRNA（模拟物或抑制剂，可单独使用或组合使用），以将MG重编程为RPC，进而获得神经元样细胞特征27。本方法已进行优化，可加快细胞培养速度，从而最大限度减少人工环境随时间推移所引起的细胞改变24,28,29。
视网膜解离与原代穆勒胶质细胞培养的生长阶段
最早在第一天即可观察到第一个肌无力症状 体外 使用光学显微镜观察。MG 具有管状、细长的形态以及浅灰色的细胞体（
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讨论
本方案描述了如何从解离的小鼠视网膜中培养穆勒胶质细胞（MG），用于miRNA介导的重编程研究。如多项先前研究所示并证实，这些培养物中绝大多数细胞（80%–90%）为MG20,23,24。该方法是一种非常稳健且可靠的培养技术，只要严格按照方案操作，结果易于重复21,27。然而，培养物的成功生长及其重编程效率取决于多种因素。
首先，小鼠的年龄对细胞成功生长具有重要作用。因此，如果从野生型小鼠或表型类似于野生型的转基因小鼠（如报告基因小鼠）中培养Müller胶质细胞（MG），获得融合MG单层的最晚时间为出生后第12天（P12）。在P12阶段，所有视网膜神经元和MG均已分化，视网膜中不再存在视网膜前体细胞（RPCs）。MG表达成熟的MG标志物，如谷氨酰胺合成酶或谷氨酸-天冬氨酸转运体（GL.......
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披露
华盛顿大学已就本报告中包含的部分研究成果向发明人Nikolas Jorstad、Stefanie G. Wohl和Thomas A. Reh提交了专利申请。该专利的名称为“刺激视网膜再生的方法和组合物”。
致谢
作者感谢 Ann Beaton 博士及实验室所有成员对本文手稿提出的宝贵意见。特别感谢 Tom Reh 博士、Julia Pollak 博士和 Russ Taylor 博士在 S.G.W. 于西雅图华盛顿大学进行博士后培训期间，将其引入使用穆勒胶质细胞（MG）原代培养作为筛选工具的方法。本研究由 Empire Innovation Program（EIP）向 S.G.W. 提供的资助、纽约州立大学视光学院向 S.G.W. 提供的启动资金，以及美国国立眼科研究所（NEI）授予 S.G.W. 的 R01EY032532 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 动物 | |||
| Ascl1-CreERT 小鼠 Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | 杰克逊实验室 | #012882 | Ascl1-CreERT 小鼠与 tdTomato 小鼠杂交 |
| tdTomato-STOPfl/fl 小鼠 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | 杰克逊实验室 | #007914 | 基因分型是鉴定 Ascl1CreER 阳性小鼠所必需的 |
| 试剂 | |||
| (Z)-4-羟基他莫昔芬， ≥98% Z 异构体 | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | 在乙醇中重新溶解，分装后冷冻 |
| 16 % 甲醛（PFA）水溶液 | VWR | 100504-782 | 2% PFA（用磷酸盐缓冲液 PBS 配制），冷冻分装 |
| Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')₂2 片段驴抗兔IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究实验室 | 711-546-152 | 稀释比例 1:500 |
| Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')₂2 片段驴抗山羊IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究实验室 | 705-606-147 | 稀释比例 1:500 |
| 抗人 Otx2 抗体，R&D系统 | Fisher Scientific | AF1979 | 稀释比例 1:500 |
| 抗兔MAP2抗体 | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | 稀释比例 1:250 |
| 抗红色荧光蛋白（RFP）抗体 | Antibodies-Online | ABIN334653 | 稀释比例 1:500 |
| 抗坏血酸 | STEMCELL Technologies | 72132 | 在 PBS 中重悬，分装冻存 |
| B-27 补充剂 | Fisher Scientific | 17-504-044 | 冷冻分装样品 |
| 脑生理神经元培养基 | STEMCELL Technologies | 05790 | 在1.2节中用作神经元培养基质，储存于 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 成像试剂盒 | Fisher Scientific | C10340 | 按照说明书进行重悬， 4°C |
| 二丁酰-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | 用二甲基亚砜（DMSO）重悬，分装冻存 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| 胎牛血清（FBS） | Fisher Scientific | MT35010CV | 冻存分装样本 |
| Gibco Opti-MEM 低血清培养基，含 GlutaMAX 补充剂 | Fisher Scientific | 51-985-034 | 储存于 4 °C |
| Gibco TrypLE Express 酶（1X），酚红 | Fisher Scientific | 12-605-028 | 含有胰蛋白酶的溶液，储存于 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | 储存于 4 °C |
| 小鼠层粘连蛋白，天然 | Fisher Scientific | 23-017-015 | 冻存分装样本，(https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-谷氨酰胺 | Fisher Scientific | 25-030-081 | 冻存分装样本 |
| miRIDIAN microRNA 模拟物阴性对照 | 地平线 | CN-001000-01-50 | 用无RN酶水重悬（200 µM），冷冻分装样品 |
| miRIDIAN microRNA 小鼠 mmu-miR-25-3p 模拟物 | 地平线 | C-310564-05-0050 | 用无RN酶水重悬（200 µM），冷冻分装样品 |
| N-2 补充剂 | Fisher Scientific | 17-502-048 | 冷冻分装样品 |
| Neurobasal 培养基 | Fisher Scientific | 21-103-049 | 用于第1.1节生长培养基，储存于 4 °C |
| 木瓜蛋白酶解离系统 | 沃辛顿生物化学 | LK003153 | 在Earle平衡盐溶液中重悬，分装后冷冻 |
| 青霉素-链霉素 | Fisher Scientific | 15-140-122 | 冻存分装样本 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| 聚-L-鸟氨酸氢溴化物 | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | 用无菌水重悬，分装后冷冻 |
| 重组人BDNF蛋白 | R&D系统 | 248-BDB-050/CF | 用无菌 PBS 和 FBS 重悬，分装后冻存 |
| 重组小鼠 EGF 蛋白 | Fisher Scientific | 2028EG200 | 用无菌 PBS 重悬，分装后冻存 |
| 重组大鼠GDNF蛋白 | Fisher Scientific | 512GF010 | 用无菌 PBS 重悬，分装后冻存 |
| 罗丹明红 570 - AffiniPure F(ab')2 片段驴抗大鼠IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究实验室 | 712-296-150 | 稀释比例 1:1,000 |
| 封片介质 | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| 转染试剂（Lipofectamine 3000） | Fisher Scientific | L3000015 | 储存于 4 °C |
| 塑料器皿/耗材 | |||
| 0.6 mL 微量离心管 | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL 提示 无菌滤器 移液器吸头 | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL 提示 无菌滤膜移液器吸头 | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP 无菌滤膜吸头 | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL 微量离心管 | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL 提示 无菌滤膜移液器吸头 | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 可调体积移液器（2.5、10、20、100、200、 & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| 一次性移液管 | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| 12孔平底带盖培养板 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24孔带盖平底多孔板 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| 移液器 无菌滤器 10 mL 一次性血清移液管 | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 移液器 无菌滤器 50 mL 一次性血清移液管 | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| 移液器 无菌滤器 5 mL 一次性血清移液管 | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 无粉丁腈检查手套 | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| 圆形盖玻片（直径12 mm，厚度0.17–0.25 mm） | Fisher Scientific | 22293232 | |
| 真空滤器，孔径=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| 设备 | |||
| 1300 B2 生物安全柜 | 赛默飞世尔科技 | 1310 | |
| 一体化荧光显微镜 Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| 双目变焦立体显微镜 | 视觉科学 | VS-1EZ-IFR07 | |
| 一次性培养皿（100 mm 直径） | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 镊子 - 生物学/钛合金 | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 镊子 - 生物学/不锈钢 | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 弯头镊子 - 生物学/钛合金 | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf 离心机 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| 精细剪刀-锋利 | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas 剪刀，8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| 金属珠浴 | Lab Armor | 74309-714 | |
| 摆动式混合器，电气=115V，60Hz，转速=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| 硅胶涂层解剖培养皿（90 mm 直径） | 生命系统仪器设备 | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| 镊子，经济型 #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| 水套式CO2培养箱 | VWR | 10810-744 |
参考文献
- Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
- Roesch, K., et al. The transcript....
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重印与许可
