肌动球蛋白束的形成 体外 并介绍了使用光镊测量肌球蛋白集合力生成的方法，同时对此进行了讨论。
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方法文章
利用光镊探测肌球蛋白在肌动蛋白细丝束中的集合力学行为
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
肌球蛋白是一类运动蛋白，可通过水解ATP沿肌动蛋白丝（AF）轨道行进，在细胞运动和肌肉收缩等细胞过程中发挥关键作用。为了理解其产生力的机制，肌球蛋白II已在单分子（SM）水平以及多分子协同作用的层面得到研究。 体外 使用光镊等生物物理方法。
这些研究表明，当从三珠结构中的单分子水平研究转变为刚性珠或盖玻片表面滑动结构中多个马达蛋白协同工作时，肌球蛋白产生力的行为可能存在显著差异。然而，这些检测方法无法评估肌球蛋白在类似于细胞内的黏弹性结构层级中所表现出的群体动力学行为。我们开发了一种利用光镊的方法，用于研究肌球蛋白群体与多条肌动蛋白丝相互作用时产生力的力学机制。
这些肌动蛋白-肌球蛋白束可在分层且具有顺应性的环境中促进对马达蛋白间通信及整体力输出的研究。该检测方法具有可定制性，允许改变实验条件，以理解对肌球蛋白整体、肌动蛋白丝束或周围环境的修饰如何导致不同的力输出结果。
引言
分子马达对生命至关重要，可将化学能转化为机械功1,2,3。肌球蛋白马达通过在肌动蛋白丝上类似轨道行走的方式与之相互作用，肌动蛋白-肌球蛋白网络的动力学过程执行肌肉收缩、细胞运动、胞质分裂过程中的收缩环以及细胞内物质运输等关键功能3,4,5,6,7,8。由于肌球蛋白具有多种关键功能，其与肌动蛋白网络的功能障碍可能导致疾病发生，例如肌球蛋白重链的突变可导致肥厚型心肌病（HCM）中的心脏过度收缩9,10,11,12,13,
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方案
1. 蚀刻盖玻片
- 在1,000 mL烧杯中，将100 g KOH溶解于300 mL 100%乙醇中。用磁力搅拌器搅拌，直至大部分KOH溶解。
注意：浓KOH溶液可引起皮肤灼伤并损坏衣物。操作时需佩戴手套、护目镜和实验服。 - 将盖玻片逐个放入盖玻片清洗架中。
注：清洗架设计有狭缝，可将单个盖玻片分隔开，以便对盖玻片的每一面进行蚀刻和冲洗，底部设有排水孔，且材质需能耐受强腐蚀条件。此类清洗架可定制或商业购买。 - 准备并标记三个1,000 mL烧杯：一个装有300 mL乙醇，另两个各装300 mL反渗透（RO）水。
注：此处RO水来自实验室纯水系统，若无本地纯水设备，也可购买市售RO水。 - 将四个烧杯均置于超声波清洗仪中，超声脱气5分钟。
- 将装有盖玻片的清洗架浸入KOH与乙醇混合液的烧杯中，超声处理5分钟。
- 将盖玻片清洗架从KOH/乙醇混合液烧杯转移至仅含乙醇的烧杯中，上下浸入烧杯中，直至无液滴成珠现象。
注：操作时应小心，避免扰动盖玻片或将清洗架用力投入烧杯，以免盖玻片脱落或引起化学试剂飞溅。 - 小心地将盖玻片清洗架从乙醇烧杯转移至盛水烧杯中，上下浸入，直至无液滴成珠现象。
- 将盖玻片清洗架浸入尚未使用的另一杯水中，再次超声处理5分钟。
- 用洗瓶向盖玻片清洗架喷水，直至水流在盖....
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结果
含有肌动球蛋白束系统的流动池采用标准设计，由显微镜载玻片和蚀刻盖玻片组成，二者之间通过双面胶带形成的通道隔开（图1）。实验体系自盖玻片开始，按照方案中所述的分步添加方式进行构建。最终的实验体系包含作为模板的罗丹明标记肌动蛋白丝；所需浓度的肌球蛋白（代表性结果中使用了1 μM，见图2和图3）；生物素化、Alexa Fluor 488标记的肌动蛋白丝；1 μm链霉亲和素磁珠；氧气清除系统；ATP；以及APB缓冲液。每个流动池中会形成多个束状结构，上述肌动蛋白浓度可使各束之间保持足够的间距，避免发生非预期的相互作用。这也有利于在单个流动池内获取多个力测量数据，从而提高数据采集效率。力谱在同一个流动池内以及不同流动池之间应具有良好的可重复性。
尽管上述方案主要针对商用光镊装置，但本文所介绍的流动池及实验方法也可轻松应用于其他商用仪器或自制的光镊系统，只要该系统配备显微镜或显微镜载物台，并具备荧光成像能力即可。按照.......
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讨论
一个 体外 使用光镊结合荧光成像的研究方法，用于探究肌球蛋白复合体与肌动蛋白丝相互作用的动力学过程。通过肌肉肌球蛋白II构建肌动蛋白-肌球蛋白-肌动蛋白束结构，其中束底部及盖玻片表面使用罗丹明标记的肌动蛋白，束顶部则使用488标记且生物素化的肌动蛋白丝。兔骨骼肌来源的肌动蛋白在通用肌动蛋白缓冲液（GAB）和肌动蛋白聚合缓冲液（APB）中进行聚合与稳定。GAB与APB必须每日在实验室内使用ATP、FC缓冲液和TC缓冲液新鲜配制。肌肉肌球蛋白II用于形成肌动蛋白-肌球蛋白-肌动蛋白三明治结构。鬼笔环肽用于肌动蛋白丝的荧光染色及稳定性维持。 体外.
肌球蛋白活性可通过标准的滑动微丝实验进行验证，该方法此前已有报道46,47。肌球蛋白II及其亚片段可以多种取向结合到盖玻片表面，且与使用重酶解肌球蛋白的实验相比，尾部结构域的存在可能会减缓微丝的滑动速度46,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作部分由密西西比大学研究生理事会研究奖学金（OA）、密西西比大学莎莉·麦克唐纳-巴克斯代尔荣誉学院（JCW、JER）、密西西比空间资助联盟（资助编号 NNX15AH78H，JCW、DNR）以及美国心脏协会（资助编号 848586，DNR）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 肌动蛋白（生物素标记）：骨骼肌 | 细胞骨架 | AB07-A | 生物素标记的肌动蛋白 |
| 肌动蛋白，兔骨骼肌来源 | 细胞骨架 | AKL99-A | 肌动蛋白 |
| Alexa Fluor 488 鬼笔环肽 | Invitrogen | A12379 | 肌动蛋白稳定剂及 Alexa Fluor 488 荧光染料 |
| ATP | Fisher scientific | BP413-25 | 用于肌动蛋白组装和肌球蛋白运动 |
| β-D-葡萄糖 | Fisher scientific | MP218069110 | 用于减少荧光成像过程中光漂白的氧气清除系统组分 |
| 印迹级封闭剂（酪蛋白） | Biorad | 1706404 | 用于阻断表面非特异性结合 |
| CaCl2 | Fisher scientific | C79500 | 氯化钙，用于调控肌动蛋白-肌球蛋白网络的动力学 |
| 过氧化氢酶 | Fisher scientific | ICN10040280 | 用于减少荧光成像过程中光漂白的氧气清除系统组分 |
| 盖玻片 | Fisher scientific | 12544C | 用于构建流动池 |
| DTT | Fisher scientific | AC327190010 | 用于缓冲液配制 |
| 乙醇 | Fisher scientific | A4094 | 用于清洗盖玻片的试剂 |
| 葡萄糖氧化酶 | Fisher scientific | 34-538-610KU | 用于减少荧光成像过程中光漂白的氧气清除系统组分 |
| KCl | Fisher scientific | P217-500 | 用于缓冲液配制 |
| KOH | Fisher scientific | P250-1 | 用于蚀刻盖玻片及调节缓冲液 pH |
| MgCl2 | Fisher scientific | M33-500 | 用于缓冲液配制 |
| 显微镜载玻片 | Fisher scientific | 12-544-2 | 用于构建流动池 |
| 肌球蛋白 II 蛋白：兔骨骼肌来源 | 细胞骨架 | MY02 | 从兔骨骼肌中分离的全长肌球蛋白马达蛋白 |
| Nanotracker2 | Bruker/JPK | NT2 | 光镊仪器 |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P8920 | 促进肌动蛋白丝在盖玻片玻璃表面的黏附 |
| 罗丹明鬼笔环肽 | 细胞骨架 | PHDR1 | 肌动蛋白稳定剂及罗丹明荧光染料 |
| 链霉亲和素磁珠，1 μm | Spherotech | SVP-10-5 | 光镊操作手柄 |
| Tris-HCl | Fisher scientific | PR H5121 | 用于缓冲液配制 |
参考文献
- Goldstein, L. S. Kinesin molecular motors: transport pathways, receptors, and human disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 6999-7003 (2001).
- Lee Sweeney, H., Holzbaur, E. L. F.
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重印与许可
