培养与遗传操作昆虫病原线虫

摘要

昆虫病原线虫与细菌共生，二者共同作用，通过破坏昆虫的先天免疫系统成功感染宿主。为了促进对线虫感染遗传基础的研究，本文描述了昆虫病原线虫的保种及遗传操作方法。

摘要

异小杆线虫属（Heterorhabditis）和斯氏线虫属（Steinernema）中的昆虫病原线虫是生活在土壤中、专性寄生昆虫的线虫。其生命周期的主要特征是分别与发光杆菌属（Photorhabdus）和类志贺氏杆菌属（Xenorhabdus）细菌形成互利共生关系。这些线虫寄生体能够定位并侵入合适的昆虫宿主，抑制昆虫的免疫反应，并高效繁殖，产生下一代主动寻找并感染新昆虫猎物的线虫。由于其生命周期的特性，昆虫病原线虫被广泛用作生物防治制剂，常与杀虫剂联合使用以控制农业上具有破坏性的害虫。同时，这些寄生性线虫也作为一种研究工具，用于分析线虫的致病性以及宿主对线虫的防御反应。近年来发展的遗传学技术和转录组学方法有助于揭示线虫在感染过程中分泌分子的功能，推动了相关研究。本文提供了一套详细的实验方案，用于维持昆虫病原线虫的培养，并实施基因沉默操作。这些方法进一步促进了对昆虫病原线虫感染因子的功能鉴定。

引言

近年来，由于昆虫病原线虫（EPN）在综合害虫管理策略中的应用价值及其在基础生物医学研究中的作用，相关研究日益深入^1,2。最近的研究已确立EPN作为模式生物，用于研究在感染过程不同阶段被激活的线虫遗传组分。这些信息为寄生虫分泌的、用于改变宿主生理状态并破坏昆虫先天免疫反应的分子的性质和数量提供了关键线索^3,4。同时，这些知识通常还结合了关于昆虫宿主免疫信号通路类型及其所调控功能的新发现，以限制病原体的侵入与扩散^5,6。理解这些过程对于全面认识EPN与其昆虫宿主之间动态相互作用的两个方面至关重要。对EPN与昆虫宿主关系的深入理解，无疑将促进对哺乳动物寄生性线虫的类似研究，从而有助于鉴定和表征干扰人类免疫系统的感染相关因子。

嗜菌性线虫 Heterorhabditis sp. 和 Steinernema sp. 可感染多种昆虫，其生物学特性此前已被广泛研究。这两种寄生性线虫的繁殖方式不同：Heterorhabditis 为自体受精，而 Steinernema 通常....

方案

1. 共生线虫感染性幼虫的制备

1. 在培养皿（10 cm）中铺一张滤纸，并放入约 10–15 条 Galleria mellonella 幼虫（图 1A）。
2. 使用移液器将 2 mL 含有约每 10 µL 悬液 25–50 条感染性幼虫（IJs）的水溶液滴加到蜡虫上。将培养皿置于室温下的柜子中保存。
3. 根据滤纸的湿润程度，每隔 2 天添加 1–2 mL 水。被 IJs 感染的蜡虫通常在 48 小时内死亡。
4. 在蜡虫感染 IJs 约 10 天后，准备 White 氏水诱捕装置⁸（图 1B、C）。小心地将死亡的昆虫转移到滤纸上未浸湿的部分。用自来水注满底部的培养皿，并将一个 15 mL 离心管的盖子倒置作为支撑物，以提供通风间隙。
5. 使用塑料镊子缓慢从滤纸上提起柔软且脆弱的蜡虫，小心转移。请使用自来水而非去矿物质水或去离子水，后者会导致线虫聚集。
   1. 确保水诱装置中的水位达到培养皿高度的大约一半。注意水位会随房间内的温度和湿度条件随时间发生变化。
6. 当小培养皿中的水因存在线虫而变得浑浊时，使用移液器将新一代的 IJs 转移至 T2....

结果

为了评估经过无菌化处理的 H. bacteriophora 线虫的状态，需确定其感染性幼虫（IJs）中是否存在 P. luminescens 细菌菌落。为此，收集约500条经表面消毒并用PBS缓冲液匀浆处理的IJs，制成沉淀。阳性对照组为含有共生 P. luminescens 细菌的线虫培养物中约500条IJs的沉淀。将无菌化处理组和阳性对照组的线虫沉淀在1×PBS中进行匀浆处理，随后将匀浆液用移液器接种至琼脂平板上，并涂布均匀以促进单个菌落的生长。琼脂平板在28 °C条件下培养24小时。次日观察 P. luminescens 菌落（CFU）的出现情况。结果如预期所示，来自保种培养物的 H. bacteriophora 携带共生的 P. luminescens 细胞；而缺乏相关 P. luminescens 细菌的线虫则为无菌状态，并被单独保存以供后续实验使用（图6）。

以敲低nol-5

讨论

要理解昆虫病原线虫感染的分子基础以及昆虫对线虫的免疫防御机制，必须将线虫寄生体与其共生细菌分离开来^13,15,16。H. bacteriophora 和 S. carpocapsae 这两种昆虫病原线虫分别与革兰氏阴性菌 P. luminescens 和 X. nematophila 共生¹⁷。先前研究表明，这两种细菌均编码能够靶向昆虫组织并在感染过程中抑制先天免疫系统的致病因子^18,19。这阻碍了人们识别线虫在与昆虫宿主相互作用过程中所进化出的适应策略。因此，通过构建无菌线虫（axenic worms），有助于鉴定并进行功能表征——特别是对参与感染过程的线虫组分进行基因敲低分析。本文提供了高效制备无菌昆虫病原线虫以及.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	VWR	97062-244
Ambion Megascript T7 试剂盒	Thermo Fisher Scientific	AM1333
氨苄青霉素	Fisher Scientific	611770250
细胞培养瓶 T25	Fisher Scientific	156367
细胞培养瓶 T75	Fisher Scientific	156499
ChoiceTaq 预混液	Denville Scientific	C775Y42
玉米油	VWR	470200-112
玉米糖浆	MP Biomedicals/VWR	IC10141301
10 mL 培养管	Fisher Scientific	14-959-14
Eppendorf Femtotips 微量加样尖端	Eppendorf	E5242956003
乙醇	Millipore-Sigma	E7023
50 mL Falcon 管	Fisher Scientific	14-432-22
Femtojet 微注射仪	Eppendorf	5252000021
滤纸	VWR	28320-100
大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫	Petco	-
玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-553-464	50 × 24 mm
卤碳油 700	Sigma	H8898
接种环	VWR	12000-806
卡那霉素	VWR	97062-956
Kwik-Fil 硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments	1B100F-3	1.0 mm
LB 琼脂	Fisher Scientific	BP1425-500	LB 琼脂 Miller 粉末 500 g
LB 肉汤	Fisher Scientific	BP1426-500	LB 肉汤 Miller 粉末 500 g
Leica DM IRB 倒置研究显微镜	Microscope Central	-
麦康凯培养基	Millipore-Sigma	M7408-250G
MEGAclear 转录纯化试剂盒	Thermo Fisher Scientific	AM1908
微量离心管	VWR	76332-064	1.5 ml
NanoDrop 2000 分光光度计	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
针头注射器	VWR	BD305155	22G
营养肉汤	Millipore-Sigma	70122-100G
Parafilm 封口膜	VWR	52858-076
分区培养皿	VWR	490005-212
PBS	VWR	97062-732	PBS 缓冲液片剂 生物技术级 200 片
PCR 引物	Azenta	-
研杵	Millipore-Sigma	BAF199230001	Bel-Art 一次性研杵
6 cm 培养皿	VWR	25384-092	60 × 15 mm
10 mm 培养皿	VWR	10799-192	35 × 10 mm
蛋白胨 #3	Thermo Fisher Scientific	211693
酵母提取物	Millipore-Sigma	Y1625