原代培养中分化的小鼠脂肪细胞:胰岛素抵抗模型

Summary

该协议描述了从皮下脂肪中分离小鼠前脂肪细胞，它们分化为成熟脂肪细胞以及诱导胰岛素抵抗。通过蛋白质印迹的胰岛素信号通路成员的磷酸化/激活来评估胰岛素作用。该方法可以直接测定原代脂肪细胞的胰岛素抵抗/敏感性。

Abstract

胰岛素抵抗是胰岛素对其靶细胞的影响降低，通常源于胰岛素受体信号传导的减少。胰岛素抵抗导致2型糖尿病（T2D）和其他肥胖衍生疾病的发展，这些疾病在世界范围内患病率很高。因此，了解胰岛素抵抗的潜在机制非常重要。几种模型已被用于研究 体内 和 体外胰岛素抵抗;原代脂肪细胞是研究胰岛素抵抗机制和鉴定抵消这种情况的分子和胰岛素增敏药物分子靶标的一种有吸引力的选择。在这里，我们使用用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）处理的培养物中的原代脂肪细胞建立了胰岛素抵抗模型。

通过磁细胞分离技术从胶原酶消化的小鼠皮下脂肪组织中分离出的脂肪细胞前体细胞（APC）分化为原代脂肪细胞。然后通过TNF-α治疗诱导胰岛素抵抗，TNF-是一种促炎细胞因子，可减少胰岛素信号级联反应成员的酪氨酸磷酸化/激活。通过蛋白质印迹定量胰岛素受体 （IR）、胰岛素受体底物 （IRS-1） 和蛋白激酶 B （AKT） 磷酸化降低。该方法为研究脂肪组织中介导胰岛素抵抗的机制提供了极好的工具。

Introduction

胰岛素是由胰岛β细胞产生的合成代谢激素，是葡萄糖和脂质代谢的关键调节因子。在其众多功能中，胰岛素调节葡萄糖摄取、糖原合成、糖异生、蛋白质合成、脂肪生成和脂肪分解¹。胰岛素与其受体（IR）相互作用后的初始分子信号是IR²的内在酪氨酸蛋白激酶活性的激活，导致其自身磷酸化³和随后称为胰岛素受体底物（IRS）的蛋白质家族的激活，其与衔接蛋白结合导致级联蛋白激酶的激活4.胰岛素激活两种主要的信号通路:磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）蛋白激酶B（AKT）和Ras-丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）。前者构成一个主要的分支点或节点⁴，^5，用于激活参与各种生理功能的众多下游效应子，包括调节燃料稳态，而后者调节细胞生长和分化4^，6。胰岛素作用最终取决于细胞类型和^{生理环境7}。

主要的胰岛素反应代谢组织之一是脂肪组织。白色脂肪组织是人类和啮齿动物中最丰富的脂肪类型，分布在皮下脂肪（皮肤和肌肉之间）和内脏脂肪（腹腔器官周围）中。鉴于其体积大....

Protocol

所有啮齿动物实验均由墨西哥国立自治大学神经生物学研究所生物伦理学委员会批准，协议编号075。

1.小鼠脂肪细胞前体细胞的分离

1. 对8-10周龄的雄性C57BL / 6小鼠实施安乐死（例如，通过CO₂吸入和随后的宫颈脱位）（每次分离四只动物）。用70%乙醇摩擦对小鼠进行消毒，并在处死后立即获得脂肪组织。
   注意:啮齿动物安乐死后，立即分离脂肪组织并在无菌层流罩内执行所有步骤。将小鼠保持在12小时的光照/黑暗循环下，自由获取食物和水。
2. 解剖每只小鼠的腹股沟皮下脂肪组织。仅去除脂肪组织，避免去除肌肉、皮肤或任何其他组织，并将其收集在含有 15 mL 1 型胶原酶溶液 （1.5 mg/mL） 的 50 mL 锥形管中。将 1 型胶原酶溶解在 Dulbecco 的改良鹰培养基 （DMEM） 高葡萄糖-1% 牛血清白蛋白 （BSA） 中，并通过 0.2 μm 注射器过滤器过滤。
3. 用无菌手术剪刀将脂肪组织切成小块，并通过在37°C的轨道振荡器（150rpm）中与1型胶原酶溶液孵育30分钟来消化样品（将含有脂肪和胶原酶的管放在水平位置以获得更大的振荡表面）。每10分钟检查一次消化，以确保其有效（组织降解可见）并防止消化过度（见 补充图S1）。
4. 使用200μm网状注射器（先前高压灭菌）过滤以消除未被胶原酶消化的组织。将过滤器....

Results

在过去的几年中，肥胖和T2D患病率的增加促使人们强烈寻找介导脂肪组织中胰岛素抵抗的机制。通过此处描述的方案，APC可以分化为成熟的脂肪细胞，以评估胰岛素抵抗和敏感性。一旦APC达到汇合，则需要10天才能完成分化为成熟脂肪细胞及其TNF-α介导的胰岛素抵抗诱导（图1）。

APCs显示出成纤维细胞样形态，其特征在于其扁平和细长的形状以及它们在接种后48小时完成的板的粘附（图2A）。APC需要2-5天才能达到80%汇合（取决于接种细胞的数量），此时分化过程通过暴露于分化混合物开始（图2A）。成熟的脂肪细胞在接下来的6-8天内开始出现。分化的脂肪细胞的特征在于圆形形态和脂滴的细胞内积累。高达80%的细胞在分化过程结束时分化（图2B）。

通过TNF-α处理（4ng / mL）诱导原代脂肪细胞中的胰岛素.......

Discussion

本文提供了一种研究胰岛素抵抗的方法，该方法使用用TNF-α处理的培养物中的原代脂肪细胞。该模型的优点是原代脂肪细胞可以在规定的条件下长时间培养，并严格控制细胞环境因素²⁶。测定持续时间为15-20天，尽管实验之间可能发生分化脂肪细胞百分比的变化。原代脂肪细胞比细胞系具有优势，因为它们在培养中没有持续扩增，并且更紧密地捕获了它们来源的组织多样性²⁷。此外，原代脂肪细胞允许研究不同生理病理背景下的供体，例如瘦与肥胖，男性与女性，年轻与老年以及来自不同脂肪库的细胞。该方法的另一个优点是，在APC分离后可以产生来自CRE和敲除小鼠的细胞系。

APCs分离和分化过程中的一个可能问题是这些细胞可能会失去分化能力，当在分化过程开始时超过80%汇合时，可能会发生这种情况。培养基也应非常温和地更换，尤其是在脂质积累之后，因为分化的脂肪细胞很容易从培养皿中分离。此外，每批胶原酶必须测试消化效率、细胞产量和细胞毒性²⁶。已经开发出使用CD31和CD45等阴性标志.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.分离小鼠脂肪细胞前体细胞
ACK 裂解缓冲液	LONZA	10-548E
抗生物素微珠	Miltenyi	130-090-485
抗 CD31	eBioscience	13-0311-85
AutoMACS Pro 分离器	Miltenyi
基底膜基质（基质胶）	康宁	354234
bFGF	Sigma	F0291	生长因子
BSA	Equitech-Bio， Inc.	BAC63-1000
CD45 单克隆抗体 （30-F11） - 生物素	eBioscience	13-0451-85
胶原酶，1 型	Worthington Biochem	LS004197
地塞米松	Sigma	D1756
DMEM	GIBCO	12800017
DMEM 低葡萄糖	GIBCO	31600-034
EGF	Peprotech	315-09	生长因子
FBS	GIBCO	26140-079
ITS 混合物	Sigma	I3146
L-抗坏血酸 2-磷酸	Sigma	A8960
LIF	Millipore	ESG1107	生长因子
亚油酸-白蛋白	Sigma	L9530
MCDB 201 培养基	Sigma	M6770
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
PDGF-BB	Peprotech	315-18	生长因子
青霉素-链霉素	BioWest	L0022-100
预分离过滤器（70 µm）	Miltenyi	130-095-823
纯化大鼠抗小鼠 CD16 / CD32	BD Pharmingen	553142
胰蛋白酶-EDTA	GIBCO	25300062
2.脂肪细胞分化和胰岛素抵抗诱导
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 [IBMX]	Sigma	I5879	分化混合物
BMP4	R&D Systems	5020-BP-010	分化混合物
地塞米松	Sigma	D1756	分化混合物
胰岛素	Sigma	I9278
罗格列酮	开曼	71742	分化混合物
TNF&α;	研发&D Systems	210-TA-005
3.通过 western blot
抗 β 微管蛋白抗体	Abcam	ab6046
溴酚蓝	BioRad	161-0404	Laemmli 缓冲液
EDTA	Sigma	E5134	RIPA 缓冲液
EGTA	Sigma	E4378	RIPA 缓冲液
FluorChem E 系统	蛋白质简单
甘油	Sigma	G6279	Laemmli 缓冲液
甘氨酸	Sigma	G7126	电泳和转印缓冲液
Igepal	Sigma	I3021	RIPA 缓冲液
2-巯基乙醇	Sigma	M3148	Laemmli 缓冲液
甲醇	JT Baker	907007	转印缓冲液
NaCl	JT Baker	3624-05	TBS-T
NaF	Sigma	77F-0379	RIPA 缓冲液
NaOH	JT Baker	3722-19
Na4P2O7	Sigma	114F-0762	RIPA 缓冲液
Na3VO4	Sigma	S6508	RIPA 缓冲液
硝酸纤维素膜	BioRad	1620112
脱脂奶粉	BioRad	1706404	封闭液
预染蛋白标准品	BioRad	1610395
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	P8340-5ML
过氧化物酶 AffiniPure 驴抗兔 IgG （H+L）	Jackson ImmunoResearch	711-035-132
磷酸化 - 胰岛素受体和 β;	细胞信号转导	3024
Phospho-Akt （Ser473） Antibody 细胞	信号转导	9271
Phospho-IRS1 （Tyr608） 抗体	Millipore	9432
糖精	JT Baker	407205	RIPA 缓冲液
SDS	BioRad	1610302	电泳和 laemmli 缓冲液
SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物	Thermo Scientific	34577
Tris-base	Promega	H5135	电泳、转印和 laemmli 缓冲液
Tris-HCl	JT Baker	4103-02	RIPA 缓冲液 - TBS
Tween 20	适马	P1379	TBS-T