小鼠脂肪源性间充质干细胞向老龄小鼠卵母细胞的线粒体转移

摘要

本文介绍了从小鼠脂肪来源的间充质干细胞中分离线粒体，随后将线粒体转移至老龄小鼠卵母细胞中，以提高卵母细胞质量。

摘要

由于卵母细胞的数量和质量随年龄增长而下降，35岁以上女性的生育能力已显著降低。目前维持卵母细胞质量的分子机制尚不明确，因此提高35岁以上女性的出生率仍存在困难。卵母细胞所含的线粒体数量超过体内任何其他类型的细胞，任何线粒体功能障碍都可能导致卵母细胞质量下降。20世纪90年代，卵母细胞胞质移植在人类生殖领域取得了显著成功，但也引发了伦理争议。自体线粒体移植有望成为提高因年龄增长而导致质量下降的卵母细胞质量的一种有效技术。在本研究中，我们采用来自老龄小鼠的脂肪来源干细胞作为线粒体供体，以提高老龄小鼠卵母细胞的质量。自体线粒体移植技术的进一步发展将为高龄女性不孕症提供一种新的有效治疗手段。

引言

影响女性生育能力的重要因素之一是卵母细胞老化；卵母细胞质量下降是高龄女性不孕的主要原因。然而，卵母细胞老化的根本原因以及调控卵母细胞质量的分子机制仍不明确。先前的研究表明，线粒体的数量和质量均参与卵母细胞的质量控制及胚胎发育^1,2,3。线粒体在数量和质量上的减少与衰老密切相关³。

为改善衰老卵母细胞中线粒体的功能，人们已进行了多种尝试，包括线粒体营养补充和线粒体移植。众所周知且有效的线粒体营养补充剂包括辅酶Q10（CoQ10）、α-硫辛酸（α-LA）和白藜芦醇（RSV）⁴。研究表明，补充CoQ10不仅可改善与年龄相关的卵母细胞数量和质量下降，还能促进卵母细胞的正常发育和排卵⁵。α-LA可延缓与衰老相关的卵母细胞质量下降以及多囊卵巢综合征（PCOS）患者的代谢表型恶化^6,7。白藜芦醇可减少衰老小鼠中异常纺锤体和染色体排列异常的卵母细胞数量，同时以剂量依赖的方式影响胚胎发育⁸。然而，由于线粒....

方案

所有描述的动物实验均经苏州大学附属第三医院动物研究伦理委员会批准。所有操作均遵循适当的动物护理和使用机构及国家指南。有关本方案中使用的所有材料、仪器和试剂的详细信息，请参见材料表。

1. 老年小鼠脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）的分离与鉴定

1. 在戊巴比妥钠麻醉下通过颈椎脱位处死老龄小鼠（10月龄，平均三只），并在分离脂肪组织前将其浸入75%酒精中5分钟。
   注意：在75%酒精中浸泡5分钟可有效减少原代细胞的污染。
2. 在双侧腹股沟皮肤上做2 cm切口，暴露皮下脂肪，用镊子分离皮下脂肪。使用无菌眼科剪刀收集小鼠双侧腹股沟脂肪（避免剪切皮下组织）。将脂肪组织置于预冷的15 mL无菌离心管中，并立即运送至细胞培养实验室。
3. 将脂肪组织转移至6孔板中，用含100 U/mL青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次。去除脂肪组织下方的血管、脂肪筋膜及结缔组织，并将其切成约0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm的小块。
   注意：在分离脂肪干细胞时，常伴有血管内皮细胞的污染。从脂肪组织中去除血管可减少血管内皮细胞的污染。
4. 将剪碎的脂肪组织转移至等体积的I型胶原酶溶液（I型胶原酶终浓度为0.1%），在37 °C下消化30分钟。
5. 加入等体积的完全培养基（含10%胎牛血清的DMEM F-12培养....

结果

在本实验方案中，我们从小鼠脂肪组织中分离并鉴定了脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）（图1）。为了获得分离的线粒体，必须使用玻璃匀浆器破坏细胞膜（图2A）。获得均匀的线粒体组分且无大块团聚物至关重要，以避免微注射管路堵塞。首先使用200 µL，然后使用10 µL移液枪头轻柔重悬匀浆液；最后，需用29 G针头缓慢吸取两到三次，以获得可用于注射的线粒体组分（图2B）。采用线粒体膜电位荧光探针进行标记，以确认所提取的线粒体具有活性（图2C）。通过JC-1流式细胞术和Western blot分析线粒体的纯度和功能（图2D、E）。

为缩短显微注射时间，预先将去尾精子置于线粒体组分中，并在注射过程中将线粒体组分从冷冻状态逐渐平衡至室温

讨论

卵母细胞所含的线粒体数量超过体内任何其他类型的细胞，其线粒体DNA拷贝数约为1-5 × 10⁵。线粒体对卵母细胞的成熟、受精以及胚胎发育至关重要，因此任何线粒体功能障碍都可能导致卵母细胞质量下降。线粒体数量和质量的减少与生理性衰老密切相关。本实验方案介绍了一种简单的方法，从老龄小鼠的脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）中分离线粒体，并将其转移至老龄小鼠的卵母细胞中，以尝试改善老化卵母细胞的质量。

自1997年科学家完成世界上首例卵母细胞胞质移植实验，并成功改善高龄患者的卵母细胞质量以来，线粒体移植技术便受到广泛关注。然而，异体线粒体移植存在伦理、法律问题，以及线粒体遗传异质性可能带来的长期健康风险。近年来，由于卵原干细胞的发现，自体卵原干细胞线粒体移植受到更多关注；但卵原干细胞的获取需采用高度侵入性方法，且难以培养和纯化，限制了其应用²⁰。脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）可通过微创技术获取，易于分离和培养²¹，是再生医学理想的"种子"细胞。更重要的是.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶/EDTA	Gibco	25300054	细胞培养
4% 多聚甲醛	beyotime	P0099	免疫荧光
40 μm 细胞筛	Corning	352340	ADSC 分离
成脂诱导剂	Cyagen	HUXXC-90031	多向分化
茜素红染色液	Sigma	A5533	多向分化
抗 CD29 抗体	BD Biosciences	558741	流式分析
抗 CD34 抗体	BD Biosciences	560942	流式分析
抗 CD90 抗体	BD Biosciences	553016	流式分析
抗 HLA-DR 抗体	BD Biosciences	555560	流式分析
β-actin	Abcam	ab-8226	线粒体功能检测
BSA	Sigma	V900933	免疫荧光
CCCP	Solarbio	C6700	线粒体 JC-1 流式分析
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711	qPCR
I 型胶原酶	Sigma	SCR103	ADSC 分离
DAPI	Invitrogen	D1306	免疫荧光
DMEM-F12	Gibco	11320033	细胞培养
DMSO	Sigma	276855	线粒体 JC-1 流式分析
EGTA	Sigma	324626	线粒体分离
FBS	Gibco	10100147	细胞培养
流式细胞仪	BD Biosciences	FACSCanto™ II	ADSC 特性鉴定
荧光显微镜	leica	DM2500	免疫荧光
明胶	Sigma	48722	多向分化
玻璃匀浆管	Sangon	F519062	线粒体分离
hCG	Aibei	M2520	卵巢超数排卵
透明质酸酶	Sigma	H1115000	卵巢超数排卵
倒置显微镜	Olympus	IMT-2	显微注射
线粒体分离染色试剂盒	Sigma	CS0760	线粒体 JC-1 流式分析
JC-1	Sigma	T4069	线粒体功能检测
KCl	Sigma	P5405	线粒体转移
KH2PO4	Sigma	P5655	线粒体转移
LaminB	Abcam	ab-16048	线粒体功能检测
M16 培养基	Sigma	M7292	胚胎细胞培养
M2 培养基	Sigma	M7167	胚胎细胞培养
甘露醇	Sigma	M9546	线粒体转移
显微注射仪	Olympus+ eppendorf	IX73	线粒体转移
MitoTracker 红色染料	Invitrogen	M22425	线粒体染色
MOPS	Sigma	M1442	线粒体分离
神经丝中等链多肽 (NFM)	Santa Cruz Biotechnology	sc-16143	多向分化
成神经诱导剂	Gibco	A1647801	多向分化
神经元特异性烯醇化酶 (NSE)	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	多向分化
油红 O	Sangon	E607319	成脂分化
油红 O 溶液	Sigma	O1516	多向分化
成骨诱导剂	Cyagen	HUXXC-90021	多向分化
PBS (磷酸盐缓冲液)	Hyclone	SH30256.LS	细胞培养
青霉素和链霉素	Hyclone	SV30010	细胞培养
PMSG	Aibei	M2620	卵巢超数排卵
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	P8340	线粒体分离
蔗糖	Sigma	V900116	线粒体分离
Tris	Sigma	648314	线粒体分离
Tris-HCl	Sigma	108319	线粒体转移
Triton X-100	beyotime	P0096	免疫荧光
VDAC	Abcam	ab-14734	线粒体功能检测