マイクロCTを用いた骨折治癒の評価
1Center for Orthopaedic Research and Translational Science (CORTS),The Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation,The Pennsylvania State University College of Medicine, 3Department of Pharmacology,The Pennsylvania State University College of Medicine, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology,The Pennsylvania State University College of Medicine
Summary
マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)は、前臨床試験で骨構造を評価するのに役立つ非破壊イメージングツールですが、骨治癒カルスを分析するためのμCT手順についてはコンセンサスがありません。この研究は、骨折治癒のモニタリングを可能にする段階的なμCTプロトコルを提供します。
Abstract
マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)は、トランスレーショナルサイエンス研究における骨折治癒中の骨および新たに形成された骨の3次元(3D)形態を特徴付けるための最も一般的なイメージングモダリティです。げっ歯類の長骨折治癒の研究には、通常、二次治癒と石灰化カルスの形成が含まれます。形成されたカルスの形状および新たに形成された骨の密度は、時点および治療の間で実質的に異なり得る。無傷の皮質骨および骨梁のパラメータを定量化するための標準的な方法論が広く使用されており、市販のソフトウェアに組み込まれているのに対し、治癒カルスを分析するための手順についてはコンセンサスが欠如している。この研究の目的は、治癒カルスの骨体積分率とカルスミネラル密度を定量化する標準化されたプロトコルを説明することです。このプロトコルでは、イメージング中のサンプルアライメント、対象ボリュームのサイズ、カルスを定義するために輪郭を描くスライスの数など、イメージングおよび分析中に考慮すべきさまざまなパラメーターが記述されています。
Introduction
マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)イメージングは、前臨床骨研究で広く使用されており、骨の微細構造を評価するための非侵襲的で高解像度の画像を提供しています1,2,3,4,5。μCTには、回転するサンプルから、または回転するX線源と検出器を使用して取得された多数のX線画像が含まれます。アルゴリズムは、画像スライスのスタックの形式で3D体積データを再構築するために使用されます。臨床CTは人間の骨の3Dイメージングのゴールドスタンダードであり、μCTは実験動物の骨治癒効率を評価するために一般的に使用される技術です1、2、3、4、6、7。石灰化した骨はX線に対するコントラストが優れていますが、軟部組織は造影剤を使用しない限りコントラストが比較的低くなります。骨折治癒の評価において、μCTは、石灰化カルスの3D構造と密度に関する詳細情報を提供する画像を生成します。in vivo μCTスキャンは、骨折治癒の縦断的、時間経過的評価にも使用できます。
μCTを用いた無傷の皮質骨および骨梁骨の定量化は、一般的に十分に確立され、標準化されています8。前臨床試験では、骨折治癒を分析するためにさまざまな定量化方法論を使用していますが9,10,11、カルス定量のためのμCT画像解析の詳細なプロトコルはまだ公開されていません。したがって、この研究の目的は、マイクロCTイメージングと骨治癒カルスの解析のための詳細なステップバイステップのプロトコルを提供することです。
Protocol
以下のプロトコルは、安楽死させたマウスから採取した長骨治癒カルスを特徴付けるために開発されました。ただし、ほとんどのステップはラットに適用でき、骨折した骨の in vivo スキャンにも使用できます。このプロトコルは、特定のμCTシステムと特定の画像処理、分析、および視覚化ソフトウェア( 材料表を参照)を記述していますが、方法論は一般的に他のスキャナ?…
Representative Results
骨折治癒中の骨形成をモニターするために、成体の雄C75BL / 6Jマウスに中骨幹開放脛骨骨折が誘発されました。骨折は、二次治癒の確立されたモデルである髄内釘を使用して安定化されました13。カルス組織は、骨折後12日目の14、21、および28日目に採取した。これらの時点は、癒しのさまざまな段階を表しています。二次骨治癒中の軟骨内骨形成は、線維?…
Discussion
この研究の目的は、骨および骨折治癒研究においてしばしば基本となる3D石灰化カルス構造の正確な定量化を目的としたμCT分析の詳細なプロトコルを説明することです。このプロトコルは、画像の視覚化、セグメンテーション/ラベリング、および単純なものから複雑なものまでの測定を容易にする汎用の最先端の3D画像解析ソフトウェアプラットフォームを利用しています。
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、国立衛生研究所(NIH)のR01 DK121327からRAEおよびR01 AR071968からF.K.の支援を受けました。
Materials
| 10% neutral buffered formalin | Fisher chemical | SF100-20 | Used for bone tissue fixation |
| Avizo | Thermo Scientific | Image processing and analysis software | |
| Hydroxyapatite phantom | Micro-CT HA D4.5, QRM | QRM-70128 | |
| Image Processing Language | Scanco | Used to convert raw images to DICOM images | |
| Micro-Mosquito Straight Hemostatic Forceps | Medline | Used to remove the intramedullary pin | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| Scanco mCT system (vivaCT 40) | Scanco | Used for µCT imaging |
References
- Rüegsegger, P., Koller, B., Müller, R. A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture. Calcified Tissue International. 58 (1), 24-29 (1996).
- Müller, R., et al. Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography. Bone. 23 (1), 59-66 (1998).
- Waarsing, J. H., et al. Detecting and tracking local changes in the tibiae of individual rats: a novel method to analyse longitudinal in vivo micro-CT data. Bone. 34 (1), 163-169 (2004).
- Boyd, S. K., Davison, P., Müller, R., Gasser, J. A. Monitoring individual morphological changes over time in ovariectomized rats by in vivo micro-computed tomography. Bone. 39 (4), 854-862 (2006).
- Christiansen, B. A. Effect of micro-computed tomography voxel size and segmentation method on trabecular bone microstructure measures in mice. Bone Reports. 5, 136-140 (2016).
- Holdsworth, D. W., Thornton, M. M. Micro-CT in small animal and specimen imaging. Trends in Biotechnology. 20 (8), 34-39 (2002).
- Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Morgan, E. F., et al. Micro-computed tomography assessment of fracture healing: Relationships among callus structure, composition, and mechanical function. Bone. 44 (2), 335-344 (2009).
- O’Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50 (6), 1357-1367 (2012).
- Bissinger, O., et al. Fully automated segmentation of callus by micro-CT compared to biomechanics. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 12 (1), 108 (2017).
- Brown, M. L., et al. Delayed fracture healing and increased callus adiposity in a C57BL/6J murine model of obesity-associated type 2 diabetes mellitus. PLOS One. 9 (6), 99656 (2014).
- Khajuria, D. K., et al. Aberrant structure of fibrillar collagen and elevated levels of advanced glycation end products typify delayed fracture healing in the diet-induced obesity mouse model. Bone. 137, 115436 (2020).
- Sigurdsen, U., Reikeras, O., Hoiseth, A., Utvag, S. E. Correlations between strength and quantitative computed tomography measurement of callus mineralization in experimental tibial fractures. Clinical Biomechanics. 26 (1), 95-100 (2011).
- Duvall, C. L., Taylor, W. R., Weiss, D., Wojtowicz, A. M., Guldberg, R. E. Impaired angiogenesis, early callus formation, and late stage remodeling in fracture healing of osteopontin-deficient mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (2), 286-297 (2007).
- Gerstenfeld, L. C., et al. Comparison of effects of the bisphosphonate alendronate versus the RANKL inhibitor denosumab on murine fracture healing. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 196-208 (2009).
- Alentado, V. J., et al. Validation of the modified radiographic union score for tibia fractures (mRUST) in murine femoral fractures. Frontiers in Endocrinology. 13, 911058 (2022).
- Yu, K. E., et al. Enhancement of impaired MRSA-infected fracture healing by combinatorial antibiotics and modulation of sustained inflammation. Journal of Bone and Mineral Research. 37 (1), 1352-1365 (2022).
- Nyman, J. S., et al. Quantitative measures of femoral fracture repair in rats derived by micro-computed tomography. Journal of Biomechanics. 42 (7), 891-897 (2009).
- Fiset, S., et al. Experimental validation of the radiographic union score for tibial fractures (RUST) using micro-computed tomography scanning and biomechanical testing in an in-vivo rat model. The Journal of Bone and Joint Surgery. 100 (21), 1871-1878 (2018).
- Shefelbine, S. J., et al. Prediction of fracture callus mechanical properties using micro-CT images and voxel-based finite element analysis. Bone. 36 (3), 480-488 (2005).
- Liu, Y., et al. Glucocorticoid-induced delayed fracture healing and impaired bone biomechanical properties in mice. Clinical Interventions in Aging. 13, 1465-1474 (2018).
- Watson, P. J., Fitton, L. C., Meloro, C., Fagan, M. J., Gröning, F. Mechanical adaptation of trabecular bone morphology in the mammalian mandible. Scientific Reports. 8 (1), 7277 (2018).
- Nie, C., Wang, Z., Liu, X. The effect of depression on fracture healing and osteoblast differentiation in rats. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 1705-1713 (2018).
Cite This Article
Wee, H., Khajuria, D. K., Kamal, F., Lewis, G. S., Elbarbary, R. A. Assessment of Bone Fracture Healing Using Micro-Computed Tomography. J. Vis. Exp. (190), e64262, doi:10.3791/64262 (2022).