使用台式仪器进行全基因组测序（WGS）策略的可行性，已使实验室环境下对所有与公共卫生相关的微生物进行基因组分析变得更加简便。本文描述了细菌全基因组测序工作流程的方法学改进，并提供了一套用于分析的生物信息学流程。
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利用全基因组测序对源自罗非鱼（Oreochromis spp.）养殖场的一种致病性Escherichia coli菌株进行表征
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摘要
摘要
水产养殖是全球增长最快的食品生产领域之一，罗非鱼（Oreochromis spp.) 养殖构成了主要的淡水鱼类养殖品种。由于水产养殖易受到来自人为来源的微生物污染，因此需要大量使用抗生素，导致水产养殖系统成为具有临床意义的抗生素耐药性和致病性细菌的重要来源，例如 大肠杆菌（Escherichia coli）. 此处描述了一种病原体的抗菌药物耐药性、毒力及可移动基因组特征 E. coli 菌株，源自内陆养殖环境 Oreochromis spp. 的基因组特征通过全基因组测序（WGS）得以阐明，且 计算机模拟 分析。进行抗菌药物敏感性试验（AST）和全基因组测序（WGS）。此外，利用多种现有的网络工具确定系统发育群、血清型、多位点序列分型（MLST）、获得性抗菌药物耐药性、毒力因子、质粒及前噬菌体组成。 E. coli 仅对氨苄西林表现为中介敏感，经基于WGS的分型鉴定为ONT:H21-B1-ST40菌株。尽管仅检测到一个与抗菌药物耐药相关的基因[mdf(A)]，来自非典型肠致病性大肠杆菌的多个毒力相关基因（VAGs） E. coli 鉴定出非典型致病性大肠杆菌（aEPEC）血清型。此外，检测到大型质粒群中的质粒复制子携带内容以及18个与前噬菌体相关的区域。综上所述，对分离自墨西哥锡那罗亚州某鱼类养殖场的aEPEC菌株进行全基因组测序（WGS）表征，有助于深入了解其潜在致病性及食用生食水产养殖产品可能带来的人类健康风险。有必要利用下一代测序（NGS）技术研究环境微生物，并采用“同一健康”（one health）框架，以探究健康问题的起源。
引言
水产养殖是全球增长最快的食品生产行业之一，其生产方式旨在满足人类日益增长的食品需求。全球水产养殖产量从1997年的3400万吨（Mt）增长至2017年的1.12亿吨（Mt）1。主要养殖物种类群包括海藻、鲤科鱼类、双壳类、鲶鱼和罗非鱼（Oreochromis spp.），其产量约占总产量的75%1。然而，由于集约化养殖模式，由微生物引起的疾病难以避免，可能导致严重的经济损失2。
在水产养殖实践中，抗生素的使用广泛用于预防和治疗细菌感染，这是影响生产效率的主要限制因素3,4。然而，残留的抗生素会在养殖沉积物和水中积累，施加选择性压力，并改变与鱼类相关及环境中固有细菌群落的结构5,6,7,8。因此，水产养殖环境成为抗菌抗性基因（ARGs）的储存库，并促进耐药细菌（ARB）在周边环境中的进一步出现和传播9。除....
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方案
注意：该 E. coli 通过处理并培养鱼类样本以测定粪大肠菌群（FC），分离出ACM5菌株12在鱼类采样期间，鱼类未表现出疾病的临床症状，也无细菌或真菌感染迹象，平均温度为 22.3 °C 占主导地位。分离后， E. coli 该分离株进行了生化检测，并在含8%（v/v）DMSO作为冷冻保护剂的脑心浸液（BHI）肉汤中冷冻保存。
1. 冻存样本的复苏 E. coli ACM5 菌种储备培养物
- 从冻存的菌种中取出冻存管，用无菌接种环、移液枪头或无菌牙签轻轻刮取冻存菌体表面。
- 将菌体划线接种于Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，在37 ± 2 °C条件下培养24小时。
2. 抗菌敏感性测定
注意：此处所述的抗菌药物敏感性试验基于美国临床和实验室标准协会（CLSI）指南（M02 Ed13:2018）的纸片扩散法31。质量控制需使用大肠埃希菌（E. coli）ATCC 25922 菌株。
- 通过菌落悬浮法制备接种物
- 从步骤1.2....
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结果
采用纸片扩散法测定抗菌药物敏感性，并根据CLSI折点标准对涵盖六类不同抗菌药物（即氨基糖苷类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类、硝基呋喃类、苯酚类和叶酸途径拮抗剂）的12种抗生素进行判读。E. coli ACM5对所有测试抗生素均敏感，仅对一种β-内酰胺类药物例外。共测试了四种β-内酰胺类药物：氨苄西林、羧苄西林、头孢噻吩和头孢三嗪。其中，氨苄西林的抑菌圈直径为14 mm。因此，根据CLSI对氨苄西林的判读标准（敏感：≥17 mm；中介：14–16 mm；耐药：≤13 mm）32，E. coli ACM5对氨苄西林表现为中介敏感。
E. coli ACM5 采用台式测序仪进行全基因组测序（WGS）。因此，按照所述方案对DNA样本进行制备、多重化并测序。总体而言，采用中等输出配置的测序运行产生了 3.37 Gb 的数据，错误率为 0.73%，其中 89.71% 的碱基质量值超过 Q3033。 specifically，对 E. coli.......
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讨论
本研究介绍了一种使用台式测序仪对致病性E. coli变异株进行细菌全基因组测序（WGS）的实验流程改进方案，以及相应的基因组表征分析流程。根据所使用的测序平台不同，湿实验操作（细菌培养、基因组DNA提取、文库制备和测序）和序列分析的周转时间（TAT）可能会有所差异，特别是在研究生长缓慢的细菌时。按照上述WGS方案操作，周转时间在4天以内，与目前文献报道的结果（<5天）相当34。
基因组测序的理论测序深度 E. coli ACM5 的测序深度计算为 30x。然而，测序实际产生的基因组组装实证数据深度为 38x。如先前所建议35，这足以获得完整的基因组代表性，并进行后续数据分析，以研究其抗菌素耐药性、毒力因子和可移动基因组特征 E. coli ACM5. 针对抗菌药物耐药性，仅对获得性耐药决定因素进行了研究。 E. coli ACM5 是一种耐氨苄青霉素的分离株，但仅检测到编码 MdfA 多药外排泵的基因。然而，该.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢墨西哥国家科学技术委员会（西班牙语缩写为 CONACyT）向 José Antonio Magaña-Lizárraga [编号：481143] 提供的博士奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Accublock Mini 数字干浴器 | Labnet | D0100 | 用于试管孵育的干浴器 |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | 用于DNA文库纯化的磁珠溶液 |
| DeNovix DS-11 | DeNovix Inc. | 紫外-可见分光光度计，用于检测提取的基因组DNA质量 | |
| DNA LoBind 管 | Eppendorf | 0030108418 | 用于DNA文库合并的1.5 mL PCR管 |
| DynaMag-2 磁力架 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 12321D | 基于磁珠的DNA纯化过程中使用的磁性微量离心管架 |
| 革兰氏阴性菌 Multibac I.D. | Diagnostic Research（墨西哥） | PT-35 | 用于抗菌药物敏感性试验的商用标准抗生素纸片 |
| MiniSeq 中通量试剂盒（300个循环） | Illumina | FC-420-1004 | 用于双端测序（2×150）的试剂盒 |
| MiniSeq 测序系统仪器 | Illumina | SY-420-1001 | 用于下一代测序的台式测序仪 |
| MiniSpin 离心机 | Eppendorf | 5452000816 | 用于试管的常规离心机 |
| Nextera XT DNA文库制备试剂盒 | Illumina | FC-131-1024 | 用于构建测序用DNA文库的试剂，包含用于24个样本的试剂盒1和试剂盒2 |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 | Index A、B、C、D 四组索引 |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | 用于测序的DNA文库对照 |
| Precision 水浴摇床 | LabCare America | 51221081 | 用于细菌培养的水浴摇床 |
| Qubit 1X dsDNA HS 检测试剂盒 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q33231 | 基于荧光的DNA定量检测试剂 |
| Qubit 2.0 荧光计 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q32866 | 用于荧光检测的荧光计 |
| Qubit 检测管 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q32856 | 用于基于荧光的DNA定量检测的0.5 mL PCR管 |
| SimpliAmp 热循环仪 | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific | A24811 | 用于DNA文库扩增的热循环仪 |
| Spectronic GENESYS 10 Vis | Thermo | 335900 | 用于抗菌药物敏感性试验中细菌悬液的分光光度计 |
| ZymoBIOMICS DNA Miniprep 试剂盒 | Zymo Research Inc. | D4300 | 基因组DNA提取试剂盒（50次制备） |
参考文献
- Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
- Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 2/02/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:
José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental
to:
José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental
