Estrazione Lumican dalla membrana amniotica e determinazione della sua temperatura di conservazione
Summary
Il presente protocollo descrive l’estrazione di lumican dalla membrana amniotica (AM) e le loro condizioni di conservazione come estratto AM (AME) a -20 °C, 4 °C e temperatura ambiente (RT) per 6, 12, 20 e 32 giorni per quantificare le sue proteine e la concentrazione di lumican.
Abstract
Lumican è un piccolo proteoglicano ricco di leucina nella membrana amniotica umana (AM) che promuove l’epitelizzazione corneale e l’organizzazione delle fibre di collagene, mantenendo la trasparenza corneale. Nel presente lavoro, viene proposto un metodo per l’estrazione di proteine da AM per ottenere lumican. Inoltre, viene valutata la stabilità del lumican nell’estratto AM (AME) conservato a diverse temperature e periodi di tempo. 100 mg di AM sono stati scongelati e deepitelizzati meccanicamente. L’AM deepitelizzato è stato congelato e frantumato fino ad ottenere una polvere fine, che è stata solubilizzata con 2,5 ml di tampone salino con inibitori della proteasi e centrifugata per l’estrazione delle proteine. Il surnatante è stato raccolto e conservato a -20 °C, 4 °C e temperatura ambiente (RT) per 6, 12, 20 e 32 giorni. Successivamente, il lumican è stato quantificato in ogni AME. Questa tecnica consente un protocollo accessibile e acquisibile per l’estrazione lumican da AM. La concentrazione di lumican è stata influenzata dal tempo di conservazione e dalle condizioni di temperatura. Lumican nell’AME di 12 giorni conservato a -20 °C e 4 °C era significativamente più alto rispetto ad altri AME. Questa estrazione lumicana potrebbe essere utile per lo sviluppo di trattamenti e soluzioni farmaceutiche. Sono necessari ulteriori studi per determinare gli usi di AME lumican nella riepitelizzazione e nel processo di guarigione delle ferite.
Introduction
Uno dei trattamenti più utilizzati per le affezioni corneali è il trapianto di membrana amniotica; Tuttavia, negli ultimi anni, sono emerse nuove proposte per l’utilizzo di vari componenti del tessuto amniotico come trattamenti alternativi e adiuvanti. Tra i componenti più studiati dell’AM ci sono quelli ottenuti dall’estratto di AM (AME)1,2,3,4,5,6,7. AM contiene molteplici fattori solubili come proteine antiangiogeniche, interleuchine (IL), inibitori tissutali delle metalloproteinasi (TIMP), proteine antinfiammatorie mediate da TSG-6 che inibiscono le trappole extracellulari dei neutrofili, fattori di crescita: fattore di crescita epidermico (EGF), fattore di crescita trasformante (TGF) (alfa e beta), fattore di crescita dei cheratinociti (KGF), fattore di crescita degli epatociti (HGF) e lumican, che mantiene la trasparenza corneale regolando la fibrillogenesi del collagene1, 2,3,4,5,6,7,8,9.
Lumican è un piccolo proteoglicano ricco di leucina (SLRP), uno dei principali componenti extracellulari della collagenasi interstiziale nella matrice dello stroma corneale, responsabile dell’organizzazione delle fibre di collagene e del mantenimento della trasparenza corneale 4,10,11. I proteoglicani sono molecole della matrice extracellulare (ECM), che sono le principali nello svolgimento della segnalazione cellulare e nel mantenimento dell’omeostasi intracellulare12. È stato riportato che le proteine ECM guidano i processi cellulari di proliferazione, differenziazione e migrazione durante la guarigione delle ferite11.
L’evidenza indica la possibile partecipazione di lumican nel processo di riepitelizzazione corneale. Saika et al., in uno studio, hanno dimostrato che dopo una lesione corneale, il lumican potrebbe essere rilevato nei cheratociti corneali tra le prime 8 ore e fino a 3 giorni dopo l’infortunio. Presentando la più alta concentrazione di lumican il secondo e il terzo giorno, questo proteoglicano è successivamente non rilevabile il settimo giorno13. Questi dati suggeriscono la partecipazione di lumican all’attivazione del processo di riepitelizzazione corneale. D’altra parte, in un altro studio, è stato riportato che l’assenza di lumican ritarda la riepitelizzazione; È interessante notare che l’aggiunta di Lumican potrebbe accelerare il processo di riepitelizzazione 4,11,13. Allo stesso modo, uno studio recente ha riportato che il lumican può modulare le funzioni infiammatorie dei fibroblasti del limbus corneale14, il che suggerisce un ruolo per il lumican come modulatore della risposta infiammatoria, antifibrotica e riepitelizzante. Allo stesso modo, il lumican può modulare la risposta corneale interagendo con molecole di segnalazione come Fas-FasL. Inoltre, l’assenza di lumican in un modello murino Lum–/- knockout ha dimostrato che la mancanza di segnalazione lumican impedisce un’adeguata riparazione corneale15.
In primo luogo, questo metodo mira a dimostrare un modo fattibile e accessibile per estrarre lumican da AM. Con questo vantaggioso metodo di estrazione lumican, è possibile ottenere concentrazioni simili di proteine, diminuendo il tempo di elaborazione e rendendolo più conveniente per gli sperimentatori rispetto agli studi precedenti16. Inoltre, questo AME lumican potrebbe essere utilizzato come coadiuvante per i processi di riparazione e riepitelizzazione corneale.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, la presenza di lumican è stata analizzata nell’AME e la sua correlazione diretta con la sua stabilità in diverse condizioni di conservazione. È interessante notare che, quando è stata quantificata la concentrazione totale di proteine in AME, la concentrazione proteica è aumentata dopo la conservazione. L’evidenza suggerisce tre meccanismi che potrebbero modificare la concentrazione proteica nella conservazione congelata: la denaturazione a freddo, la concentrazione congelata di soluti e lo sviluppo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Materials
| 1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
| 18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminum foil | N/A | N/A | |
| Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beaker | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figures design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
| Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
| Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mortar | N/A | N/A | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Paper towels | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
| Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
| Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
| Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
| Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
| Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultrapure water | PISA | ||
| Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |
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